Этот протокол может оценить, как целевая доставка генов влияет на локализацию и функцию клеток B-1a и может быть полезным доказательством концептуального подхода для изучения генно-терапевтического потенциала in vivo. Этот метод обеспечивает стабильную и относительно эффективную доставку генов в первичные клетки B-1a и позволяет идентифицировать фенотип донорских клеток и функционировать после принятия передачи. Этот метод может быть использован для изучения различных донорских и принимающих клеточных процессов in vivo, включая выживание клеток, распространение и функцию, и может быть применен к другим приемным системам передачи.
Сбор перитонеальной жидкости может быть сложно. Будьте уверены, чтобы полностью отключить клетки, чтобы максимизировать восстановление и избежать проколов кишечника, которые могут загрязнять ваши перитонеальные клетки населения. Для перитонеальной коллекции клеток B-1, используйте прямые хирургические ножницы, чтобы сделать поверхностный разрез в брюшной полости от 12 до 14 недель, мужчина, CD45.1'apolipoprotein E нокаут мыши, и использовать изогнутые ножницы, чтобы очистить кожу, чтобы разоблачить брюшной стенки.
Используя 10 миллилитровый шприц, оснащенный иглой 25 калибра, промыть брюшной полости с 10 миллилитров 37 градусов по Цельсию RPMI-1640 среды. И схватить основание хвоста, чтобы мышь была тщательно потрясен из стороны в сторону в течение 15 до 20 секунд. После встряхивания, использовать шприц, чтобы аспирировать жидкость с нижней правой стороны брюшной полости чуть выше уровня бедра, вблизи кишечника, заботясь, чтобы избежать нарушения эпидидимальных жировых отложений и основных органов.
Собрав от шести до семи миллилитров лаважа, выпределите жидкость в 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Используйте типсы, чтобы схватить брюшную стенку над диафрагмой, чтобы позволить вертикальное возвышение животного так, чтобы любая оставшаяся жидкость оставшегося на дне брюшной полости. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в брюшной стенке над печенью без резки самой печени.
И использовать стеклянную трубу и лампочку, чтобы собрать оставшиеся брюшной жидкости. Когда вся жидкость была собрана, aliquot перитонеальной вымывания клеток из всех мышей и добавить до одного раза от 10 до восьмой клетки на концентрацию трубки в 50 миллилитров труб на льду. И осадок клеток центрифугации.
Resuspend каждую гранулу в один миллилитр анти-CD16/CD32 антитела разбавлены на один к 50 соотношение в анализе буфера в течение 10 минут инкубации при четырех градусах цельсия. В конце инкубации, добавить равный объем биотинилированных антител мастер смеси для каждой трубки в течение 20 минут инкубации при четырех градусах по Цельсию с последующим мытьем в пять миллилитров анализа буфера на трубку. Повторное производство гранул с соответствующим объемом антибиотинных микробусов и соответствующей продолжительностью инкубации в соответствии с концентрацией клеток и рекомендацией производителя с последующим пятими миллилитровым анализом буферной мойки на трубку.
Повторное выделение каждой гранулы в 500 микролитров буфера анализа и премьер соответствующее количество магнитных столбцов отбора с тремя миллилитров анализа буфера на столбец. Перенесите клетки на загрунтные колонны, собирающие элуент, содержащий обогащенные клетки B-1 в 15-миллилитровой конической трубке на льду. Затем промойте каждый магнитный отбор колонки с дополнительным буфером анализа до тех пор, пока общий собранный объем не будет 10 миллилитров и повторно использовать посточищенные фракции клеток в один раз от 10 до шестого клеток на миллилитр концентрации в среде культуры В клеток.
Для стимуляции перитонеальной B-1 клетки откладывают по крайней мере один раз от 10 до седьмой клетки для не-трансдуцированных контроля и разделить оставшиеся клетки на два равных тома для трансдукции. Разбавить клетки в 1,5 раза от 10 до пятых клеток на 150 микролитров средней концентрации и добавить 150 микролитров клеток в скважины одной 96-хорошо круглой нижней пластины для трансдукции состоянии. Затем добавьте 100 наномоляров агониста TLR9 к каждому колодец и поместите пластины в инкубатор клеточной культуры в течение 16-18 часов.
Для ретровирусной трансдукции брюшной пол-клетки оттаивают кальций фосфатные трансфекции ретровирусных частиц запасов на льду и сразу добавляют к контролю и химиокин-рецептор ретровирусные супернатанты к каждому колодец соответствующей пластины и множественности инфекции от 20 до 1 при наличии 8 микрограмм на миллилитр полибрена и свежего бета-меркаптоэтола при 55 микрограммах на миллилитр полибрена и свежего бета-меркаптоэтола в 55 микрограммах. Когда все вирусы были добавлены, spinfect клетки центрифугации и поместить пластины в инкубатор культуры клеток в течение трех часов. В конце инкубации, урожай клеток для повторного покрытия в свежем среде В-клеток и ночь инкубации.
После магнитного истощения других типов брючных клеток, живые синглетные клетки в фракции после истощения имеют большую долю клеток CD19-B по сравнению с F4/80-макрофагами, и отсутствие CD5hi CD19-T клеток, и они содержат повышенную частоту средних клеток CD19-CD5 B-1a по сравнению с до истощения фракции. А увеличение частоты успешно транспонированных подмножебных клеток GFP-B-2, B-1, B-1a и B-1b напрямую коррелирует с увеличением размножения вируса инфекции. И эффективность трансдукции может быть дополнительно увеличена с помощью 96 хорошо круглых нижних пластин по сравнению с использованием 24-хорошо или 6-хорошо пластин.
Ретровирусная трансдукция CXCR4-GFP может вызвать успешную переэкспрессию клеток B-1 CXCR4 и увеличение миграции в пробирке к CXCL12 без существенного влияния на жизнеспособность клеток группы В. Кроме того, приемные переданные cd45.1'donor клетки выдержали их переэкспрессию CXCR4 после их восстановления от костного мозга и селезенки мышей-реципиентов CD45.2 через 17 недель после переноса клеток. Следует отметить, что была определена положительная связь между экспрессией CXCR4 и локализацией донорских клеток в костном мозге, но не селезенкой.
При положительной связи наблюдается между числами донорских клеток в костном мозге и плазмы количество анти-MDA-низкой плотности липопротеинов IgM. Многие дополнительные методы могут быть использованы для ответа на такие вопросы, как, каково влияние целевой доставки генов на развитие болезни или какой донор получает секретные факторы, влияющие на физиологию хозяина.
