פרוטוקול זה יכול להעריך כיצד אספקת גנים ממוקדת משפיעה על לוקליזציה ותפקוד של תאי B-1a והוא יכול להיות גישה שימושית של הוכחת מושג לבחינת פוטנציאל טיפולי גנים ב- vivo. שיטה זו מספקת אספקת גנים יציבה ויעילה יחסית לתאי B-1a ראשוניים ומאפשרת זיהוי של פנוטיפ תא תורם והעברה לאחר אימוץ. שיטה זו יכולה לשמש לבחינת תהליכי תאים מגוונים של תורמים ומארחים ב-vivo, כולל הישרדות תאים, התפשטות ותפקוד, וונית ליישם אותה על מערכות העברה מאמצות אחרות.
קציר נוזלים צפי יכול להיות מסובך. הקפד לנתק ביסודיות את התאים כדי למקסם את ההתאוששות כדי למנוע ניקור המעיים אשר יכול לזהם את אוכלוסיית התאים הצפק שלך. עבור אוסף תאים B-1 הצפק, להשתמש במספריים כירורגיים ישר לעשות חתך שטחי בבטן של 12 עד 14 שבועות, זכר, CD45.1 + אפוליפופרוטאין E נוקאאוט עכבר, ולהשתמש מספריים מעוגלים לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הקיר הצפק.
באמצעות מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 25 מד, לשטוף את חלל צפדית עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI-1640 בינוני. ולתפוס את הבסיס של הזנב כדי לאפשר לעכבר להיות מזועזע ביסודיות מצד לצד במשך 15 עד 20 שניות. לאחר רעידות, להשתמש במזרק כדי לשאוף את הנוזל מהצד הימני התחתון של הצפירה ממש מעל רמת הירך, ליד המעיים, דואג כדי למנוע שיבוש מחסני שומן אפידידימלי ואיברים הבסיסית.
לאחר איסוף שישה עד שבעה מיליליטר של lavage, לחלק את הנוזל לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. השתמש מטלפים כדי לתפוס את הקיר צפק מעל הסרעפת כדי לאפשר העלאה אנכית של החיה, כך שכל הנוזל הנותר נשאר בתחתית חלל צפק. השתמש מספריים כירורגיים לעשות חתך קטן בקיר צפי מעל הכבד מבלי לחתוך את הכבד עצמו.
ולהשתמש צינור זכוכית ונורה כדי לאסוף כל נוזל צפק שנותר. כאשר כל הנוזל נאסף, aliquot תאי שטיפה צפי מכל העכברים ולהוסיף עד פעם אחת 10 לתאים השמיניים לכל ריכוז צינור ב 50 צינורות מיליליטר על קרח. ולהרוס את התאים על ידי צנטריפוגה.
יש להתריע מחדש על כל גלולה במיליליטר אחד של נוגדן נגד CD16/CD32 מדולל ביחס של 1 עד 50 במאגר הבדיקות לדגירה של 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מוסיפים נפח שווה של תערובת אב נוגדנים biotinylated לכל צינור עבור דגירה של 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואחריו לשטוף בחמישה מיליליטר של חיץ assay לכל צינור. תן את הכדורים עם הנפח המתאים של microbeads אנטי ביוטין ומשך הדגירה המתאים לפי ריכוז התא והממלצת היצרן ואחריו לשטוף חיץ בדיקה חמישה מיליליטר לכל צינור.
תן שימוש חוזר בכל גלולה ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה והצב מחדש את המספר המתאים של עמודות בחירה מגנטית עם שלושה מיליליטר של מאגר בדיקה לעמודה. מעבירים את התאים לעמודים מוזהרים שאוספים את האלונט המכיל תאי B-1 מועשרים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על קרח. לאחר מכן שטפו כל עמודת בחירה מגנטית עם מאגר בדיקה נוסף עד שהנפח הכולל שנאסף יהיה 10 מיליליטר והשקיעו מחדש את שבר התא לאחר הטיהור פי 10 לריכוז השישי למיליליטר במדיום תרבות תאי B.
כדי לעורר את תאי B-1 צפי להפריש לפחות פעם אחת 10 לתאים השביעי עבור פקד שאינו מתמר ולפצל את התאים הנותרים לשני כרכים שווים עבור ההעתקה. לדלל את התאים 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 150 microliters של ריכוז בינוני ולהוסיף 150 microliters של תאים בארות של צלחת אחת 96 היטב עגול התחתון עבור מצב התמרה. לאחר מכן להוסיף 100 nanomolar של אגוניסט TLR9 לכל באר ולמקום את הצלחות ב החממה תרבות התא במשך 16 עד 18 שעות.
לתמורת רטרו-ויראלית של תאי B צפי להפשיר סידן פוספט transfection חלקיקים רטרו-ויראליים מניות על קרח מיד להוסיף לשליטה ואת קולטן כימוקין retroviral על טבעי לכל אחד גם של הצלחת המתאימה ואת ריבוי הזיהום של 20 לאחד בנוכחות 8 מיקרוגרם למיליליטר של פוליברן ובטא-mercaptoethanol טרי ב 55 ריכוז סופי micromolar. כאשר כל הווירוסים נוספו, ספיןfect התאים על ידי צנטריפוגה למקם את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. בסוף הדגירה, לקצור את התאים עבור replating בינוני תא B טרי דגירה לילה.
לאחר דלדול מגנטי של סוגי תאים צפיוניים אחרים, לתאי סינגלט חיים בשבר שלאחר הדלדול יש שיעור גדול יותר של תאי CD19+B בהשוואה ל- F4/80+מקרופאגים, ומחסור בתאי CD5hi CD19-T, והם מכילים תדירות מוגברת של תאי B-1a בינוניים CD19+CD5 בהשוואה לשבר טרום דלדול. והגברת התדירות של ערכות משנה של תאים GFP+B-2, B-1, B-1a ו- B-1b המתווספת בהצלחה לעלייה בריבוי וירוסים של זיהום. ואת יעילות ההעתקה ניתן להגדיל עוד יותר באמצעות 96 צלחות עגולות היטב לעומת השימוש של 24 היטב או 6 צלחות היטב.
התמרה רטרווירוס CXCR4-GFP יכול לגרום מוצלחת B-1 תא CXCR4 overexpression ולהגדיל את ההגירה במבחנה לכיוון CXCL12 ללא השפעה משמעותית על הכדאיות של תא B. בנוסף, תאים המועברים באימוץ CD45.1+תורם סבלו מלחץ יתר של CXCR4 לאחר החלמתם ממח העצם ו הטחול של עכברים נמען CD45.2 17 שבועות לאחר העברת התא. יש לציין כי נקבע קשר חיובי בין הביטוי CXCR4 לבין לוקליזציה של תאי התורם למח העצם אך לא טחול.
עם קשר חיובי שנצפה בין מספרי תאים תורמים במח העצם לבין כמות הפלזמה של ליפופרוטאין IgM בצפיפות נמוכה נגד מד"א. ניתן להשתמש בטכניקות נוספות רבות כדי לענות על שאלות כגון, מהי ההשפעה של אספקת גנים ממוקדת על התפתחות המחלה או אילו תורמים מפיקים גורמים מופרשים המשפיעים על הפיזיולוגיה המארחת.
