Este protocolo pode avaliar como a entrega de genes direcionada afeta a localização e função celular B-1a e pode ser uma prova útil de abordagem conceitual para examinar potenciais terapêuticos genéticos in vivo. Este método fornece uma entrega genética estável e relativamente eficiente para as células B-1a primárias e permite a identificação do fenótipo celular doador e a transferência pós-adoção. Este método pode ser usado para examinar diversos processos de células doadoras e hospedeiras in vivo, incluindo sobrevivência celular, proliferação e função, e pode ser aplicado a outros sistemas de transferência adotiva.
A colheita de fluidos peritoneal pode ser complicada. Certifique-se de desengatar completamente as células para maximizar a recuperação e evitar perfurar os intestinos que podem contaminar sua população de células peritoneal. Para a coleta de células peritoneal B-1, use uma tesoura cirúrgica reta para fazer um corte superficial no abdômen de um rato de 12 a 14 semanas de idade, masculino, CD45.1+apolipoprotein E knockout mouse, e use uma tesoura curva para descascar a pele para expor a parede peritoneal.
Usando uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 25, lave a cavidade peritoneal com 10 mililitros de 37 graus Celsius RPMI-1640 médio. E segure a base da cauda para permitir que o mouse seja completamente abalado de um lado para o outro por 15 a 20 segundos. Após tremer, use a seringa para aspirar o fluido do lado inferior direito do peritônio logo acima do nível do quadril, perto dos intestinos, tomando cuidado para evitar interromper os depósitos de gordura epidídimais e órgãos subjacentes.
Depois de coletar de seis a sete mililitros de lavage, distribua o fluido em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Use fórceps para agarrar a parede peritoneal acima do diafragma para permitir a elevação vertical do animal de modo que qualquer fluido restante permaneça na parte inferior da cavidade peritoneal. Use uma tesoura cirúrgica para fazer um pequeno corte na parede peritoneal acima do fígado sem cortar o próprio fígado.
E use uma tubulação de vidro e uma lâmpada para coletar qualquer fluido peritoneal restante. Quando todo o fluido tiver sido coletado, aliquot as células de lavagem peritoneal de todos os camundongos e adicione uma vez 10 às oitavas células por concentração de tubo em tubos de 50 mililitros no gelo. E sedimentar as células por centrifugação.
Resuspend cada pelota em um mililitro de anticorpo anti-CD16/CD32 diluído a uma proporção de um a 50 em tampão de ensaio para uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione um volume igual de mistura mestre de anticorpos biotiningados a cada tubo para uma incubação de 20 minutos a quatro graus Celsius seguido de uma lavagem em cinco mililitros de tampão de ensaio por tubo. Resuspenque as pelotas com o volume apropriado de microesferas anti-biotina e duração apropriada de incubação de acordo com a concentração celular e recomendação do fabricante seguido de uma lavagem tampão de ensaio de cinco mililitros por tubo.
Resuspend cada pelota em 500 microliters de tampão de ensaio e prime o número apropriado de colunas de seleção magnética com três mililitros de tampão de ensaio por coluna. Transfira as células para colunas primed coletando o eluent contendo células B-1 enriquecidas em um tubo cônico de 15 mililitros no gelo. Em seguida, lave cada coluna de seleção magnética com tampão de ensaio adicional até que o volume total coletado seja de 10 mililitros e resuspenda a fração celular pós-purificada em uma vez 10 a 6 células por concentração mililitro no meio da cultura celular B.
Para estimular as células peritoneal B-1 reservadas pelo menos uma vez 10 para a sétima célula para um controle não transduzido e dividir as células restantes em dois volumes iguais para transdução. Diluir as células para 1,5 vezes 10 a quinta células por 150 microliters de concentração média e adicionar 150 microliters de células a poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços para a condição de transdução. Em seguida, adicione 100 nanomolar de Agonista TLR9 a cada poço e coloque as placas na incubadora de cultura celular por 16 a 18 horas.
Para transdução retroviral das células B peritoneal descongelam estoques de partículas retrovirais de transfecção de cálcio no gelo e imediatamente adicionam ao controle e aos supernantes retrovirais do receptor de quimioterapia para cada poço da placa apropriada e multiplicidade de infecção de 20 para um na presença de 8 microgramas por mililitro de polibreno e beta-mercaptoetanol fresco em 55 concentração final de micromolar. Quando todos os vírus foram adicionados, a spinfect as células por centrifugação e coloca as placas na incubadora de cultura celular por três horas. No final da incubação, colde as células para replação em meio de célula B fresca e uma incubação durante a noite.
Após o esgotamento magnético de outros tipos de células peritoneais, as células singlet vivas na fração pós-esgotamento têm uma maior proporção de células CD19+B em comparação com f4/80+macrófagos, e a falta de células CD5hi CD19-T, e contêm uma frequência aumentada de células B-1a médias CD19+CD5 em comparação com a fração de pré-esgotamento. E o aumento na frequência de subconjuntos de células GFP+B-2, B-1, B-1a e B-1b transduzidos com sucesso está diretamente correlacionado com o aumento da multiplicidade de infecção por vírus. E a eficiência de transdução pode ser ainda maior usando 96 placas bem redondas em comparação com o uso de placas de 24 poços ou 6 poços.
A transdução de retrovírus CXCR4-GFP pode induzir uma superexpressão CXCR4 de célula B-1 bem sucedida e aumentar a migração in vitro para CXCL12 sem um impacto significativo na viabilidade celular B. Além disso, as células cd45.1+doadoras adotadas sofreram sua superexpressão CXCR4 após sua recuperação da medula óssea e do baço de camundongos receptores CD45.2 17 semanas após a transferência de células. Note-se que foi determinada uma associação positiva entre a expressão CXCR4 e a localização da célula doadora à medula óssea, mas não o baço.
Com uma associação positiva observada entre o número de células doadoras na medula óssea e a quantidade plasmática de igM de lipoproteína de baixa densidade anti-MDA. Muitas técnicas adicionais podem ser utilizadas para responder a perguntas como, qual é o impacto da entrega de genes direcionados no desenvolvimento de doenças ou qual doador deriva fatores secretos que afetam a fisiologia do hospedeiro.
