Questo protocollo può valutare in che modo l'erogazione mirata del gene influisce sulla localizzazione e sul funzionamento delle cellule B-1a e può essere un utile approccio proof of concept per esaminare i potenziali terapeutici genetici in vivo. Questo metodo fornisce un parto genico stabile e relativamente efficiente alle cellule B-1a primarie e consente l'identificazione del fenotipo cellulare donatore e del trasferimento post-adottivo della funzione. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare diversi processi di cellule donatrici e ospiti in vivo, tra cui la sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la funzione, e può essere applicato ad altri sistemi di trasferimento adottivo.
La raccolta del fluido peritoneale può essere complicata. Assicurati di disimpegnare accuratamente le cellule per massimizzare il recupero ed evitare di forare l'intestino che può contaminare la tua popolazione cellulare peritoneale. Per la raccolta cellulare peritoneale B-1, utilizzare forbici chirurgiche dritte per fare un taglio superficiale nell'addome di un topo knockout da 12 a 14 settimane, maschio, CD45.1 +apolipoproteina E e utilizzare forbici curve per sbucciare la pelle per esporre la parete peritoneale.
Utilizzando una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 25, sciacquare la cavità peritoneale con 10 millilitri di 37 gradi Celsius RPMI-1640 medium. E afferrare la base della coda per consentire al mouse di essere completamente scosso da un lato all'altro per 15-20 secondi. Dopo aver tremato, utilizzare la siringa per aspirare il fluido dal lato inferiore destro del peritoneo appena sopra il livello dell'anca, vicino all'intestino, facendo attenzione a evitare di interrompere i depositi di grasso epididimale e gli organi sottostanti.
Dopo aver raccolto da sei a sette millilitri di lavanda, erogare il fluido in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Utilizzare le forcep per afferrare la parete peritoneale sopra il diaframma per consentire l'elevazione verticale dell'animale in modo che qualsiasi fluido rimanente rimanga nella parte inferiore della cavità peritoneale. Utilizzare forbici chirurgiche per fare un piccolo taglio nella parete peritoneale sopra il fegato senza tagliare il fegato stesso.
E utilizzare una pipetta di vetro e una lampadina per raccogliere qualsiasi fluido peritoneale rimanente. Una volta raccolto tutto il fluido, aliquote le cellule di lavaggio peritoneale di tutti i topi e aggiungere fino a una per 10 all'ottava concentrazione di tubi per tubo in tubi da 50 millilitri sul ghiaccio. E sedimentare le cellule per centrifugazione.
Resuspend ogni pellet in un millilitro di anticorpo anti-CD16/CD32 diluito con un rapporto uno a 50 nel tampone di dosaggio per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, aggiungere un volume uguale di miscela master di anticorpi biotinilati a ciascun tubo per un'incubazione di 20 minuti a quattro gradi Celsius seguita da un lavaggio in cinque millilitri di tampone di dosaggio per tubo. Resuspend i pellet con il volume appropriato di microperline anti-biotina e durata di incubazione appropriata secondo la concentrazione cellulare e la raccomandazione del produttore seguita da un lavaggio tampone di dosaggio di cinque millilitri per tubo.
Resuspend ogni pellet in 500 microlitri di tampone di dosaggio e innescare il numero appropriato di colonne di selezione magnetica con tre millilitri di tampone di dosaggio per colonna. Trasferire le cellule su colonne innescate raccogliendo l'eluente contenente cellule B-1 arricchite in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio. Quindi lavare ogni colonna di selezione magnetica con un buffer di dosaggio aggiuntivo fino a quando il volume complessivo raccolto è di 10 millilitri e rimospendare la frazione cellulare post-purificata a una volta 10 alla sesta concentrazione di millilitro nel mezzo di coltura cellulare B.
Per stimolare le cellule peritoneali B-1 mettere da parte almeno una per 10 alla settima parte per un controllo non trasdotto e dividere le cellule rimanenti in due volumi uguali per la trasduzione. Diluire le cellule a 1,5 per 10 alla quinta colonna per 150 microlitri di media concentrazione e aggiungere 150 microlitri di cellule a pozzi di una piastra a fondo tondo da 96 po 'per le condizioni di trasduzione. Quindi aggiungere 100 nanomolari di agonista TLR9 a ciascun pozzo e posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 16-18 ore.
Per la trasduzione retrovirale delle cellule B peritoneali scongelare le scorte di particelle retrovirali di trasfezione di fosfato di calcio sul ghiaccio e aggiungere immediatamente al controllo e al recettore delle chemiochine supernanti retrovirali ad ogni pozzo della piastra appropriata e molteplicità di infezione da 20 a uno in presenza di 8 microgrammi per millilitro di polibrene e beta-mercaptoetanolo fresco a concentrazione finale di 55 micromolare. Quando tutti i virus sono stati aggiunti, spinfect le cellule per centrifugazione e posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule per la piastratura in mezzo cellulare B fresco e un'incubazione notturna.
Dopo l'esaurimento magnetico di altri tipi di cellule peritoneali, le cellule singole vive nella frazione post-esaurimento hanno una proporzione maggiore di cellule CD19+B rispetto ai macrofagi F4/80+, e una mancanza di cellule CD5hi CD19-T, e contengono una maggiore frequenza di cellule B-1a medie CD19+CD5 rispetto alla frazione di pre-esaurimento. E l'aumento della frequenza dei sottoinsiemi di cellule GFP+B-2, B-1, B-1a e B-1b trasdotti con successo è direttamente correlato all'aumento della molteplicità virale dell'infezione. E l'efficienza di trasduzione può essere ulteriormente aumentata utilizzando 96 piastre ben rotonde rispetto all'uso di piastre da 24 o 6 pozzi.
La trasduzione del retrovirus CXCR4-GFP può indurre una sovraespressione CXCR4 a cellule B-1 di successo e aumentare la migrazione in vitro verso il CXCL12 senza un impatto significativo sulla vitalità delle cellule B. Inoltre, le cellule donatrici CD45.1+ trasferite adottivamente hanno sostenuto la loro sovraespressione CXCR4 dopo il loro recupero dal midollo osseo e dalle milza dei topi riceventi CD45.2 17 settimane dopo il trasferimento cellulare. Da notare che è stata determinata un'associazione positiva tra l'espressione CXCR4 e la localizzazione delle cellule donatrici al midollo osseo ma non alla milza.
Con un'associazione positiva osservata tra il numero di cellule donatrici nel midollo osseo e la quantità plasmatica di lipoproteina IgM a bassa densità anti-MDA. Molte tecniche aggiuntive possono essere utilizzate per rispondere a domande come, qual è l'impatto del parto genico mirato sullo sviluppo della malattia o quale donatore deriva fattori secreti influenzano la fisiologia dell'ospite.
