本视频的目的是演示成人心肌细胞分离、长期培养和转染的标准化协议。从小鼠或大鼠中隔离和培养心肌细胞，继续是研究健康和疾病心脏内心肌细胞自主生物学的基本方法。有几个问题，我们可以回答使用孤立的心肌细胞。
如增殖潜力。有基因表达变化或损伤反应时的特定细胞因子表达。不幸的是，小鼠心肌细胞在正常培养条件下无法存活一周。
因此，在这个视频中，我们描述了一种优化的方法，以隔离成年小鼠心肌细胞，转换它们，并培养它们远远超出21天，这种技术最初很难掌握。但通过实践，一个人可以达到约80-90%的存活在心肌细胞隔离后，约100%的转染效率。这些心肌细胞中大多数在正确的条件下可以存活过去20天。
清洁和消毒您的手术器械，浸泡在70%酒精15分钟，然后用双蒸馏水清洗。水后，将工具留在空气中晾干，通过运行70%酒精，每次运行5分钟，清洁灌注器。通过运行双蒸馏水 10 分钟，提高流速有助于在酒精冲洗掉任何剩余的酒精后清洁油管。
设置三个盘子来清洁切除后的心脏。在每个盘子中填充20毫升的菌细胞缓冲液。将两到三滴肝素加入每道菜，用巴斯德移液器混合，通过上下移液多次混合井。
拿一个10毫升的注射器，用菌质缓冲液填充。从注射器中去除任何气泡，并将其放在第三盘中，放在倾斜位置，用胶带固定。用手术缝合准备一个松散的结，并放在针周围。
麻醉前20分钟通过IP注射注射给小鼠注射肝素。以每分钟三毫升的流速通过灌注器循环菌质缓冲液。五分钟后，用酶溶液代替富液缓冲液，在过程中用氧气使酶溶液饱和，再次将酶溶液设置为每分钟三百分之三的流速。
通过捏到手趾来确认麻醉，将鼠标放在手术平台上。用70%酒精对皮肤进行消毒。小心地打开胸膛，锻炼心脏，把心放在第一道菜里。
通过轻轻挤压清除心脏的血液，然后将心脏转移到第二道菜，以进一步清洁心脏的血液，并去除任何非心脏组织。随后将心脏转移到第三道菜。找到大道，用你的钳子，以保持它佩顿更把它放在针周围。
通过拉下你的预紧结紧，然后作出第二个结固定它。为了增加稳定性，请确定顺序并在夹子的帮助下放置。修剪任何多余的缝合线，最后使用注射器中的菌细胞缓冲液开始心脏大量，以清除心脏中剩余的任何血液。
小心地从注射器中取出计算针，并将其钩到灌注器上。尝试防止任何气泡进入心脏。因为这可能会影响酶溶液和消化的流动。
将水套向上移动，在大量时为心脏提供均匀的环境。让酶溶液以每分钟2到3mL的速度流过心脏。让酶溶液流过心脏两分钟。
在两分钟内，将40微升的100微摩尔氯化钙溶液混合到酶溶液中。让酶溶液通过心脏再用10到15分钟。一旦水流变得光滑，心脏开始看起来棕色和柔软，你知道你有一个均匀的胶原酶分布，以实现心脏的适当消化。
当你认为你的消化是完整的，从兰根多夫灌注系统的心脏，并把它放在一个16毫米的培养皿充满了5毫升的酶溶液，并把它到生物安全的脚。小心地去除脂肪和多余的脂肪组织。在钳子的帮助下，将心脏在定义的碎片中切碎。
拿一个无菌的巴斯德移液器，并在45度切割其尖端。使用巴斯德移液器通过轻轻的移液上下打破心脏组织。最佳消化提供单细胞心肌细胞的悬浮后，添加五毫升停止溶液，以阻止酶活性，以避免过度消化，采取第一个50毫升锥形管，并放置一个无菌的100微米细胞过滤器。
通过细胞过滤器通过心肌细胞悬浮液，去除任何大块的组织。最后用停止溶液清洗过滤器，收集任何附着的心肌细胞遗骸。将电池悬浮液在 20 GS 下离心三分钟，然后丢弃上一代。
重新悬浮心肌细胞和10毫升止血溶液，每隔三分钟以10微升100毫摩尔氯化钙溶液四次混合。第四版离心机后，心肌细胞在20 GS下悬浮3分钟，并丢弃上经剂。将心肌细胞重新悬浮在培养基中，将细胞板入60毫米培养皿中，放入CO2培养箱2至3小时。
两到三个小时后主要的污染物细胞类型，如纤维爆炸将坚持在菜的服务，允许心肌细胞的纯隔离。之后，将菜从培养箱中取出，在圆锥管中收集漂浮的心肌细胞，并在层压素涂24孔培养板中重播心肌细胞。
四到六个小时足以让心肌细胞粘附在表面。因此，在电镀后六小时可以进行转染。RNA IMAX转染试剂用于移植具有西RNA的心肌细胞。
培养基含有25微摩尔血，辅以10%FBS，我们发现更适合进行长期心肌细胞培养和诱导增殖分析。转染后，您可以通过显微镜查看心肌细胞，利用微培养箱了解细胞的延时成像效果。这些是低放大率和高放大率的转染杆形心肌细胞的亮场图像。
在这里，你可以看到一天一天的成像，其中展示了成人小鼠心肌细胞形态的变化。我们确认，心肌细胞在早期点，以及D分化和长期培养后是健康和收缩的。下面是 Ki67 免疫荧光染色的例子，证明在转染后，成人心肌细胞在培养中诱导增殖。
正如你所看到的使用这种技术的结果，一个人可以从老鼠和老鼠获得健康的成人心肌细胞，并培养它们进行长期研究。总之，一旦掌握了这项技术，我们研究心肌细胞远远超出了目前的培养方案。
