El objetivo de este vídeo es demostrar un protocolo estandarizado para el aislamiento de cardiomiocitos adultos, el cultivo a largo plazo y la transfección. Aislar y cultivar cardiomiocitos de ratón o rata siguen siendo un método esencial para investigar la biología autónoma celular de los cardiomiocitos dentro del corazón sano y enfermo. Hay varias preguntas que podemos responder usando cardiomiocitos aislados.
Como el potencial proliferativo. Hay cambios en la expresión génica o expresiones específicas de citoquinas tras la respuesta a la lesión. Desafortunadamente, los cardiomiocitos de ratón no sobreviven en la última semana en condiciones normales de cultivo.
Por lo tanto, en este video, describimos un método optimizado para aislar cardiomiocitos de ratón adultos, los transfiguramos y los cultivamos mucho más allá de 21 días, esta técnica es inicialmente difícil de dominar. Pero con la práctica se puede lograr alrededor de 80 a 90% sobrevivir en cardiomiocitos después del aislamiento y alrededor de una eficiencia de transfección al 100 por ciento. Y la mayoría de estos cardiomiocitos en condiciones correctas pueden sobrevivir más allá de los 20 días.
Limpie y esterilice sus instrumentos quirúrgicos empapándolos en 70% de alcohol durante 15 minutos y posteriormente lavándolos con agua destilada doble. Después del agua, deje que las herramientas en el aire se sequen a continuación, limpie el aparato de profusión ejecutando 70%alcohol dos veces durante cinco minutos cada uno. Aumentar el caudal ayudará a limpiar el tubo después de que el alcohol enjuague cualquier alcohol restante corriendo agua destilada doble durante 10 minutos.
configurar tres platos para limpiar el corazón después de la escisión. Llene cada uno de los platos con 20 mililitros de tampones de miocitos. Agregue dos a tres gotas de heparina a cada plato con la pipeta Pasteur y mezcle Bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
Tome una jeringa de 10 mililitros y llénelo con tampón de miocitos. Retire cualquiera de las burbujas de aire de la jeringa y colóquela en el tercer plato en una posición en ángulo, asegurándola con cinta adhesiva. Prepare un nudo suelto con sutura quirúrgica y colóquelo alrededor de la aguja.
Inyecte el ratón con heparina a través de la inyección IP 20 minutos antes de la anestesia. Circule el tampón de profusión de miocitos a través del aparato de profusión a un caudal de tres mililitros por minuto. Después de cinco minutos, reemplace el tampón de profusión con solución enzimática, sature la solución enzimática con oxígeno durante el proceso, de nuevo, establezca la solución enzimática en un caudal de tres ml por minuto.
Confirme la anestesia pellizcando los dedos del dedo del de la cara y coloque el ratón en la plataforma quirúrgica. Esterilice la piel con 70%alcohol. Abra cuidadosamente el pecho, ejercite el corazón y ponga el corazón en el primer plato.
Limpie la sangre del corazón apretando suavemente, luego transfiera el corazón al segundo plato para limpiar aún más la sangre del corazón y eliminar cualquier tejido no cardíaco. Posteriormente transfiera el corazón al tercer plato. Encuentra la aorta y usa tus fórceps para mantenerla Peyton más colocándola alrededor de la aguja cánula.
Asegúrelo tirando hacia abajo de su nudo pre apretado apretando y luego haciendo un segundo nudo. Para una estabilidad adicional, fije el orden y colóquelo con la ayuda de un clip. Recorte cualquier hilo de sutura en exceso y, finalmente, inicie la profusión cardíaca utilizando el tampón de miocitos en la jeringa para eliminar la sangre que queda en el corazón.
Retire cuidadosamente la aguja de cálculo de la jeringa y enganche al aparato de profusión. Intenta evitar que las burbujas de aire entren en el corazón. Como esto puede afectar el flujo de la solución enzimática y la digestión.
Mueva la chaqueta de agua hacia arriba, para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón durante la profusión. Permita que la solución enzimática fluya a través del corazón con una velocidad de dos a tres ml por minuto. Deje que la solución enzimática fluya a través del corazón durante dos minutos.
A dos minutos, mezclar en 40 microlitros de cien micromolares solución de cloruro de calcio a la solución enzimática. Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 10 a 15 minutos. Una vez que el flujo se vuelve suave y el corazón comienza a verse marrón y suave, usted sabe que usted tiene una distribución uniforme de la enzima colagenasa para lograr la digestión adecuada del corazón.
Cuando creas que tu digestión está completa, baja el corazón del sistema de perfusión Langendorff y ponlo en un plato Petri de 16 milímetros lleno de cinco mililitros de solución enzimática y llévalo a un pie de bioseguridad. Retire cuidadosamente las aurículas y el tejido extra graso. Picar el corazón en piezas definidas con la ayuda de fórceps.
Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta a 45 grados. Utilice la pipeta Pasteur para descomponer el tejido cardíaco pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula después de que añadir cinco mililitros de solución de parada para detener la actividad enzimática para evitar la digestión excesiva, Tomar un primer tubo cónico de 50 mililitros y colocar un estéril colador de células de cien micras en él.
Pasar la suspensión del cardiomiocitos a través del colador celular para eliminar cualquier trozo grande de tejido. Finalmente lave el colador con solución de parada para recoger cualquier resto de cardiomiocitos conectado. Centrifugar la suspensión celular a 20 GS durante tres minutos y deseche el sobrenadante.
Re suspenda los cardiomiocitos y 10 mililitros de solución de parada, a intervalos de tres minutos a 10 microlitros de 100 solución de cloruro de calcio milimiolar cuatro veces y mezcle. Después de la cuarta edición centrifugar la suspensión de cardiomiocitos a 20 GS durante tres minutos y desechar el sobrenadante. Re suspenda los cardiomiocitos en medios de cultivo Pre platear las células en un plato de 60 milímetros y poner en la incubadora de CO2 durante dos a tres horas.
En dos o tres horas. Los principales tipos de células contaminantes como las explosiones de fibra se adherirán al servicio del plato, permitiendo el aislamiento puro de los cardiomiocitos. Después de eso, sacar el plato de la incubadora y recoger los cardiomiocitos flotantes en un tubo cónico y rejugó los cardiomiocitos en una placa de cultivo de 24 pozos recubierto de laminina.
De cuatro a seis horas es suficiente para que los cardiomiocitos se adhieran a la superficie. Así que la transfección podría realizarse a las seis horas después del enchapado. Se utilizó un reactivo de transfección de ARN IMAX para trasplantar cardiomiocitos con siRNAs.
El medio de cultivo contiene 25 sangre micromolar Staten complementado con 10%FBS, que hemos encontrado es más adecuado para realizar el cultivo de cardiomiocitos a largo plazo e inducir el análisis de proliferación. Después de la transfección, puede ver los cardiomiocitos mediante microscopía utilizando una micro incubadora de cómo están las células para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Estas son imágenes de campo brillante de cardiomiocitos en forma de varilla trans infectado a un aumento bajo y alto.
Aquí, se pueden ver imágenes día a día, que muestra cambios en la morfología de los cardiomiocitos de ratón adultos. Confirmamos que los cardiomiocitos son sanos y contráctiles en los primeros momentos, así como después de la diferenciación D y el cultivo a largo plazo. Este es un ejemplo de tinción inmunofluorescente Ki67 que demuestra la proliferación inducida de cardiomiocitos adultos en el cultivo después de los siRNAs, una transfección.
Como se puede ver en los resultados utilizando esta técnica, uno puede obtener cardiomiocitos adultos sanos de ratón y rata y cultivarlos para el estudio a largo plazo. En conclusión, una vez dominada esta técnica nos permitirá estudiar cardiomiocitos mucho más allá de los protocolos de cultivo actuales.
