Das Ziel dieses Videos ist es, ein standardisiertes Protokoll für Erwachsene Kardiomyozyten Isolation, Langfristige Kultur und Transfektion zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultivierung von Kardiomyozyten aus der Maus oder Ratte ist nach wie vor eine wesentliche Methode, um die zellautonome Biologie von Kardiomyozyten im gesunden und krankheitskranken Herzen zu untersuchen. Es gibt mehrere Fragen, die wir mit isolierten Kardiomyozyten beantworten können.
Wie das proliferative Potenzial. Es gibt Genexpressionsänderungen oder spezifische Zytokinausdrücke bei Verletzungsreaktion. Leider überleben Maus-Kardiomyozyten nicht nach einer Woche unter normalen Kulturbedingungen.
Daher beschreiben wir in diesem Video eine optimierte Methode, um erwachsene Maus-Kardiomyozyten zu isolieren, sie zu transfixieren und weit über 21 Tage hinaus zu kultivieren, diese Technik ist zunächst schwer zu beherrschen. Aber mit der Praxis kann man etwa 80 bis 90% überleben in Kardiomyozyten nach Isolation und etwa eine 100-prozentige Transfektionseffizienz erreichen. Und die meisten dieser Kardiomyozyten unter korrekten Bedingungen können die letzten 20 Tage überleben.
Reinigen und sterilisieren Sie Ihre chirurgischen Instrumente, indem Sie sie 15 Minuten lang in 70% Alkohol einweichen und anschließend mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Nach dem Wasser, lassen Sie die Werkzeuge in der Luft als nächstes trocknen, reinigen Sie das Überflussgerät, indem Sie 70% Alkohol zweimal für jeweils fünf Minuten laufen. Die Erhöhung der Durchflussmenge wird dazu beitragen, die Schläuche zu reinigen, nachdem Alkohol den verbleibenden Alkohol ausspülen kann, indem sie 10 Minuten lang doppelt destilliertes Wasser laufen lassen.
drei Gerichte aufstellen, um das Herz nach der Exzision zu reinigen. Füllen Sie jedes der Gerichte mit 20 Milliliter Myozytenpuffer. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen Heparin zu jeder Schale mit der Pasteur Pipette und mischen Well durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.
Nehmen Sie eine 10 Milliliter Spritze und füllen Sie sie mit Myozytenpuffer. Entfernen Sie eine der Luftblasen aus der Spritze und legen Sie sie in die dritte Schale in eine abgewinkelte Position, um sie mit Klebeband zu sichern. Bereiten Sie einen lockeren Knoten mit chirurgischer Naht vor und legen Sie ihn um die Nadel.
Injizieren Sie die Maus mit Heparin durch IP-Injektion 20 Minuten vor der Anästhesie. Zirkulieren Sie den Myozyten-Profusionspuffer durch das Profusionsgerät mit einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute. Ersetzen Sie nach fünf Minuten den Profusionspuffer durch eine Enzymlösung, sättigen Sie die Enzymlösung während des Prozesses mit Sauerstoff, stellen Sie die Enzymlösung erneut auf eine Durchflussrate von drei mLs pro Minute.
Bestätigen Sie die Anästhesie durch Zehenkneifen und legen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform. Sterilisieren Sie die Haut mit 70% Alkohol. Öffnen Sie vorsichtig die Brust, trainieren Sie das Herz und legen Sie das Herz in die erste Schale.
Reinigen Sie das Blut aus dem Herzen durch sanftes Quetschen, dann übertragen Sie das Herz auf die zweite Schale, um das Blut weiter aus dem Herzen zu reinigen und alle nicht-kardialen Gewebe zu entfernen. Anschließend das Herz auf das dritte Gericht übertragen. Finden Sie die Aorta und verwenden Sie Ihre Zange, um es Peyton mehr platzierung es um die Kanulationsnadel zu halten.
Sichern Sie es, indem Sie Ihren vorfesten Knoten anziehen und dann einen zweiten Knoten machen. Für zusätzliche Stabilität fixieren Sie die Reihenfolge und platzieren mit Hilfe eines Clips. Schneiden Sie überschüssiges Nahtgewinde, und starten Sie schließlich die Herzprofusion mit dem Myozytenpuffer in der Spritze, um das im Herzen verbleibende Blut zu löschen.
Entfernen Sie vorsichtig die Rechennadel aus der Spritze und schließen Sie sie an das Überflussgerät. Versuchen Sie, zu verhindern, dass Luftblasen ins Herz gelangen. Da dies den Fluss der Enzymlösung und Verdauung beeinflussen kann.
Bewegen Sie die Wasserjacke nach oben, um dem Herzen während der Fülle eine homogene Umgebung zu bieten. Lassen Sie die Enzymlösung mit einer Geschwindigkeit von zwei bis drei mLs pro Minute durch das Herz fließen. Lassen Sie die Enzymlösung für zwei Minuten durch das Herz fließen.
Nach zwei Minuten 40 Mikroliter hundert mikromolare Calciumchloridlösung in die Enzymlösung mischen. Lassen Sie die Enzymlösung für weitere 10 bis 15 Minuten durch das Herz passieren. Sobald der Fluss glatt wird und das Herz beginnt, braun und weich zu sehen, wissen Sie, dass Sie eine gleichmäßige Verteilung des Kollagenase-Enzyms haben, um eine ordnungsgemäße Verdauung des Herzens zu erreichen.
Wenn Sie denken, dass Ihre Verdauung abgeschlossen ist, nehmen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem und legen Sie es in eine 16-Millimeter-Petrischale, gefüllt mit fünf Milliliter enzymadienlichen Lösungen, und bringen Sie es auf einen Biosicherheitsfuß. Entfernen Sie vorsichtig die Vorhöfe und zusätzliches Fettgewebe. Schneiden Sie das Herz in definierten Stücken mit Hilfe von Zangen.
Nehmen Sie eine sterile Pasteur Pipette und schneiden Sie ihre Spitze bei 45 Grad. Verwenden Sie die Pasteur Pipette, um das Herzgewebe durch sanftes Pipetieren nach oben und unten aufzubrechen. Optimale Verdauung bietet eine Suspension von einzelzelligen Kardiomyozyten danach fügen Sie fünf Milliliter Stop-Lösung, um die Enzymaktivität zu stoppen, um über die Verdauung zu vermeiden, Nehmen Sie eine erste 50 Milliliter konische Röhre und legen Sie ein steriles hundert Mikron Zell sieben darauf.
Passieren Sie die Kardiomyozytensuspension durch das Zellsieb, um große Gewebestücke zu entfernen. Waschen Sie schließlich das Sieb mit Stop-Lösung, um alle angeschlossenen Kardiomyozytenreste zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 20 GS für drei Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Die Kardiomyozyten und 10 Milliliter Stop-Lösung in drei Minuten bei 10 Mikrolitern 100 Millimolar Calciumchloridlösung viermal aussetzen und mischen. Nach der vierten Auflage Zentrifuge die Kardiomyozyten Suspension bei 20 GS für drei Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Die Kardiomyozyten in Kulturmedien wieder aussetzen, die Zellen in eine 60-Millimeter-Schale vorladen und zwei bis drei Stunden in den CO2-Inkubator geben.
In zwei bis drei Stunden. Die Hauptschadstoff-Zelltypen wie Faserstrahlen werden dem Service der Schale zuführen, was eine reine Isolierung von Kardiomyozyten ermöglicht. Danach nehmen Sie das Gericht aus dem Brutkasten und sammeln Die schwimmenden Kardiomyozyten in einem konischen Rohr und spielen die Kardiomyozyten in einer laminierten 24 Brunnenkulturplatte nach.
Vier bis sechs Stunden reichen aus, damit die Kardiomyozyten an der Oberfläche haften können. So konnte die Transfektion sechs Stunden nach der Beschichtung durchgeführt werden. DAS RNA IMAX Transfektionsreagenz wurde zur Transplantation von Kardiomyozyten mit siRNAs verwendet.
Die Kulturmedien enthalten 25 mikromolare Blut Staten mit 10%FBS ergänzt, die wir gefunden haben, ist besser geeignet, langfristige Kardiomyozytenkultur durchzuführen und Proliferationsanalyse induzieren. Nach der Transfektion können Sie die Kardiomyozyten mittels Mikroskopie unter Verwendung eines Mikro-Inkubators anzeigen, wie die Zellen für die Zeitraffer-Bildgebung sind. Dabei handelt es sich um Hellfeldbilder von transfizierten, stabförmigen Kardiomyozyten bei niedriger und hoher Vergrößerung.
Hier können Sie Tag für Tag Bildgebung sehen, die Veränderungen in der Erwachsenen-Maus-Kardiomyozyten-Morphologie zeigt. Wir bestätigen, dass die Kardiomyozyten zu frühen Zeitpunkten sowie nach D-Differenzierung und Langzeitkultur gesund und kontraktil sind. Hier ist ein Beispiel für Ki67 immunfluoreszierende Färbung zeigt induzierte Proliferation von erwachsenen Kardiomyozyten in der Kultur nach siRNAs, eine Transfektion.
Wie Sie aus den Ergebnissen mit dieser Technik sehen können, kann man gesunde erwachsene Kardiomyozyten von Maus und Ratte erhalten und sie für eine Langzeitstudie kulturieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik, sobald sie gemeistert ist, es uns ermöglicht, Kardiomyozyten weit über die aktuellen Kultivierungsprotokolle hinaus zu studieren.
