الهدف من هذا الفيديو هو إظهار بروتوكول موحد لعزل القلب والقلب الكبار، والثقافة على المدى الطويل وtransfection. عزل واستزراع عضلة القلب من الفأر أو الفئران لا تزال وسيلة أساسية للتحقيق في بيولوجيا الخلايا المستقلة من القلب والقلب داخل القلب السليم والمرض. هناك العديد من الأسئلة التي يمكننا الإجابة عليها باستخدام أمراض القلب المعزولة.
مثل إمكانية الانتشار. هناك تغيرات في التعبير الجيني أو تعبيرات السيتوكين المحددة عند الاستجابة للإصابة. لسوء الحظ، لا البقاء على قيد الحياة القلب الماوس أسبوع واحد الماضية في ظروف الثقافة العادية.
لذلك ، في هذا الفيديو ، نحن وصف طريقة محسنة لعزل الماوس الكبار cardiomyocytes ، محولة لهم وزرعها بعد 21 يوما ، وهذا الأسلوب هو في البداية من الصعب إتقانها. ولكن مع الممارسة يمكن للمرء أن يحقق حوالي 80 إلى 90٪ البقاء على قيد الحياة في cardiomyocytes بعد العزل وحوالي كفاءة 100 في المئة transfection. ومعظم هذه القلبية في الظروف الصحيحة يمكن البقاء على قيد الحياة في الماضي 20 يوما.
تنظيف وتعقيم الأدوات الجراحية الخاصة بك عن طريق نقعها في 70٪ الكحول لمدة 15 دقيقة وغسلها في وقت لاحق مع الماء المقطر مزدوجة. بعد الماء، وترك الأدوات في الهواء لتجف المقبل، وتنظيف جهاز الافراز عن طريق تشغيل الكحول 70٪ مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. زيادة معدل التدفق سوف تساعد على تنظيف الأنابيب بعد الكحول شطف أي الكحول المتبقية عن طريق تشغيل الماء المقطر مزدوجة لمدة 10 دقائق.
إعداد ثلاثة أطباق لتنظيف القلب بعد الختان. ملء كل من الأطباق مع 20 ملليلتر من المخزن المؤقت myocyte. أضف إلى اثنين إلى ثلاث قطرات من الهيبارين إلى كل طبق مع ماصة باستور واخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
خذ حقنة 10 ملليلتر وملء مع المخزن المؤقت myocyte. إزالة أي من فقاعات الهواء من الحقنة ووضعه في الطبق الثالث في وضع الزاوية، وتأمينه مع الشريط. إعداد عقدة فضفاضة مع خياطة الجراحية ووضعها حول الإبرة.
حقن الماوس مع الهيبارين من خلال حقن IP 20 دقيقة قبل التخدير. تعميم العازلة الزبيرة myocyte من خلال جهاز الافروزيون بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلترات في الدقيقة الواحدة. بعد خمس دقائق، استبدال العازلة مع وفرة انزيم، تشبع محلول انزيم مع الأكسجين أثناء العملية، مرة أخرى، تعيين محلول انزيم إلى معدل تدفق من ثلاثة mLs في الدقيقة الواحدة.
تأكيد التخدير عن طريق معسر إصبع قدمه ووضع الماوس على منصة الجراحية. تعقيم الجلد مع 70٪ الكحول. فتح بعناية الصدر، وممارسة القلب ووضع القلب في الطبق الأول.
اطهر الدم من القلب عن طريق الضغط اللطيف، ثم نقل القلب إلى الطبق الثاني لمزيد من تنظيف الدم من القلب وإزالة أي أنسجة غير قلبية. نقل القلب في وقت لاحق إلى الطبق الثالث. العثور على الشريان الأورطي واستخدام ملقط الخاص للحفاظ على بيتون أكثر وضعه حول إبرة التكيب.
تأمين ذلك عن طريق سحب أسفل الخاص بك قبل تشديد عقدة ضيقة ومن ثم جعل عقدة ثانية. لثبات إضافي إصلاح النظام ومكان مع مساعدة من مقطع. تقليم أي خيط خياطة الزائدة، وأخيرا بدء إسراف القلب باستخدام المخزن المؤقت myocyte في الحقنة لمسح أي من الدم المتبقية في القلب.
إزالة بعناية إبرة حساب من الحقنة وربطه إلى جهاز الافراة. محاولة لمنع أي فقاعات الهواء من الخوض في القلب. لأن هذا قد يؤثر على تدفق محلول الانزيم والهضم.
نقل سترة الماء إلى أعلى، لتوفير بيئة متجانسة للقلب أثناء الوفرة. السماح لمحلول الإنزيم بالتدفق عبر القلب بسرعة 2-3 mLs في الدقيقة. دع محلول الإنزيم يتدفق عبر القلب لمدة دقيقتين.
في دقيقتين، مزيج في 40 ميكرولترات من مائة ميكرومولار محلول كلوريد الكالسيوم لمحلول انزيم. السماح لمحلول انزيم تمر عبر القلب لمدة 10 إلى 15 دقيقة أخرى. بمجرد أن يصبح التدفق سلسًا ويبدأ القلب في النظر إلى اللون البني والناعم ، فأنت تعرف أن لديك توزيعًا زوجيًا لأنزيم الكولاجين لتحقيق الهضم السليم للقلب.
عندما تعتقد أن الهضم الخاص بك هو كامل، واتخاذ القلب إلى أسفل من نظام الغمر Langendorff ووضعها في طبق بيتري 16 ملليمتر مليئة خمسة ملليلتر من محلول انزيم وأخذه إلى قدم السلامة البيولوجية. إزالة بعناية الأذين والأنسجة الدهنية الزائدة. رمّز القلب في قطع محددة مع مساعدة من ملقط.
خذ ماصة باستور العقيمة وقطع طرفها عند 45 درجة. استخدام ماصة باستور لكسر أنسجة القلب عن طريق الأنابيب لطيف صعودا وهبوطا. الهضم الأمثل يوفر تعليق من الخلايا القلبية واحدة بعد أن إضافة خمسة ملليلتر من وقف الحل لوقف نشاط انزيم لتجنب أكثر من الهضم، واتخاذ أول 50 ملليلتر أنبوب مخروطي ووضع مصفاة معقمة مائة ميكرون الخلية على ذلك.
تمرير تعليق cardiomyocyte من خلال مصفاة الخلية لإزالة أي قطع كبيرة من الأنسجة. وأخيرا غسل المصفاة مع وقف الحل لجمع أي بقايا cardiomyocyte المرفقة. الطرد المركزي تعليق الخلية في 20 GS لمدة ثلاث دقائق والتخلص من الفائق.
إعادة تعليق القلب و 10 ملليلتر من محلول التوقف، على فترات ثلاث دقائق في 10 ميكرولترات من 100 ملليمتر كلوريد كلوريد الكالسيوم حل أربع مرات ومزيج. بعد الطبعة الرابعة الطرد المركزي تعليق cardiomyocytes في 20 GS لمدة ثلاث دقائق والتخلص من supernatant. إعادة تعليق cardiomyocytes في وسائل الإعلام الثقافة قبل لوحة الخلايا في طبق 60 ملليمتر ووضعها في حاضنة CO2 لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.
خلال ساعتين أو ثلاث ساعات سيتم الالتزام بأنواع الخلايا الملوثة الرئيسية مثل انفجارات الألياف لخدمة الطبق ، مما يسمح بالعزلة النقية لـ cardiomyocytes. بعد ذلك ، أخرج الطبق من الحاضنة وجمع عضلة القلب العائمة في أنبوب مخروطي وأعيد عضلة القلب في لامينين مغلف 24 طبقًا ثقافيًا جيدًا.
أربع إلى ست ساعات كافية لـ cardiomyocytes للتمسك السطح. لذلك يمكن إجراء عملية نقل في ست ساعات بعد الطلاء. تم استخدام كاشف RNA IMAX transfection لزرع القلب مع siRNAs.
وسائل الإعلام الثقافة يحتوي على 25 ميكرومولار الدم Staten تكملها 10٪ FBS، التي وجدنا أنها أكثر ملاءمة لأداء ثقافة cardiomyocyte على المدى الطويل والحث على تحليل الانتشار. بعد transfection، يمكنك عرض cardiomyocytes عن طريق المجهر باستخدام حاضنة صغيرة لكيفية الخلايا لتصوير الوقت الفاصل. هذه هي صور brightfield من قضيب عبر عدواة على شكل cardiomyocytes في التكبير منخفضة وعالية.
هنا ، يمكنك أن ترى يوما بعد يوم التصوير ، والذي يعرض التغيرات في مورفولوجيا القلب الماوس الكبار. ونؤكد أن القلبية هي صحية وانكماشية في وقت مبكر من النقاط، وكذلك بعد التمايز D والثقافة على المدى الطويل. هنا مثال على تلطيخ مناعي Ki67 مما يدل على انتشار مستحث من أمراض القلب الكبار في الثقافة بعد siRNAs، وهو transfection.
كما ترون من النتائج باستخدام هذه التقنية، يمكن للمرء الحصول على أمراض القلب الكبار صحية من الفأر والفئران والثقافة لهم لدراسة طويلة الأجل. في الختام، مرة واحدة يتقن هذه التقنية سوف تسمح لنا لدراسة cardiomyocytes بكثير وراء البروتوكولات زراعة الحالية.
