O objetivo deste vídeo é demonstrar um protocolo padronizado para isolamento de cardiomiócitos adultos, cultura de longo prazo e transfecção. Isolar e cultivo de cardiomiócitos de camundongos ou ratos continuam a ser um método essencial para investigar a biologia autônoma celular de cardiomiócitos dentro do coração saudável e da doença. Há várias perguntas que podemos responder usando cardiomiócitos isolados.
Como o potencial proliferativo. Há alterações de expressão genética ou expressões específicas de citocinas após a resposta à lesão. Infelizmente, os cardiomiócitos do rato não sobrevivem depois de uma semana em condições normais de cultura.
Portanto, neste vídeo, descrevemos um método otimizado para isolar cardiomiócitos de camundongos adultos, transfixá-los e cultuá-los bem além de 21 dias, essa técnica é inicialmente difícil de dominar. Mas com a prática pode-se alcançar cerca de 80 a 90% sobreviver em cardiomiócitos após o isolamento e cerca de 100% de eficiência de transfecção. E a maioria desses cardiomiócitos em condições corretas pode sobreviver depois de 20 dias.
Limpe e esterilize seus instrumentos cirúrgicos, absorvendo-os em 70% de álcool por 15 minutos e, posteriormente, lavando-os com água dupla destilada. Depois da água, deixe as ferramentas no ar para secar em seguida, limpe o aparelho de profusão executando 70% de álcool duas vezes por cinco minutos cada. O aumento da vazão ajudará a limpar a tubulação depois que o álcool enxaguar qualquer álcool restante, executando água duplamente destilada por 10 minutos.
configurar três pratos para limpar o coração após a excisão. Encha cada um dos pratos com 20 mililitros de tampão de miócito. Adicione duas a três gotas de heparina em cada prato com a pipeta Pasteur e misture Bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes.
Pegue uma seringa de 10 mililitros e encha-a com tampão de miócito. Remova qualquer uma das bolhas de ar da seringa e coloque-a no terceiro prato em uma posição angular, fixando-a com fita. Prepare um Nó solto com sutura cirúrgica e coloque-o ao redor da agulha.
Injete heparina no mouse através de injeção IP 20 minutos antes da anestesia. Circule o tampão de profusão miócida através do aparelho de profusão a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto. Após cinco minutos, substitua o tampão de profusão por solução enzimápica, saturar a solução enzimápica com oxigênio durante o processo, novamente, definir a solução enzimápica para uma taxa de fluxo de três mLs por minuto.
Confirme a anestesia pelo dedo do pé e coloque o mouse na plataforma cirúrgica. Esterilize a pele com 70% de álcool. Abra cuidadosamente o peito, exercite o coração e coloque o coração no primeiro prato.
Limpe o sangue do coração apertando suavemente, em seguida, transfira o coração para o segundo prato para limpar ainda mais o sangue do coração e remover quaisquer tecidos não cardíacos. Posteriormente transfira o coração para o terceiro prato. Encontre a aorta e use seus fórceps para mantê-la Peyton mais colocando-a em torno da agulha canulante.
Fixá-lo puxando para baixo o seu nó pré-apertado apertando e, em seguida, fazendo um segundo nó. Para estabilidade adicional fixe o pedido e coloque com a ajuda de um clipe. Corte qualquer fio de sutura em excesso, e finalmente inicie a profusão cardíaca usando o tampão de miócito na seringa para limpar qualquer sangue restante no coração.
Remova cuidadosamente a agulha calculista da seringa e corte-a ao aparelho de profusão. Tente evitar que bolhas de ar entrem no coração. Como isso pode afetar o fluxo da solução esnzimada e digestão.
Mova a jaqueta de água para cima, para fornecer um ambiente homogêneo ao coração durante a profusão. Permita que a solução enzimápica flua pelo coração com uma velocidade de dois a três mLs por minuto. Deixe a solução enzimápica fluir pelo coração por dois minutos.
Em dois minutos, misture em 40 microliters de uma centena de solução de cloreto de cálcio micromolar à solução enzimápica. Deixe a solução enzimápica passar pelo coração por mais 10 a 15 minutos. Uma vez que o fluxo se torna suave e o coração começa a parecer marrom e macio, você sabe que você tem uma distribuição uniforme da enzima colagenase para obter a digestão adequada do coração.
Quando você acha que sua digestão está completa, retire o coração do sistema de perfusão langendorff e coloque-o em uma placa de Petri de 16 milímetros cheia de cinco mililitros de solução enzimada e leve-o a um pé de biossegurança. Remova cuidadosamente a atria e o tecido adiposo extra. Pique o coração em pedaços definidos com a ajuda de fórceps.
Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte a ponta a 45 graus. Use a pipeta Pasteur para quebrar o tecido cardíaco por canos suaves para cima e para baixo. A digestão ideal fornece uma suspensão de cardiomiócitos celulares únicos depois que adicionar cinco mililitros de solução de parada para parar a atividade enzimática para evitar a digestão excessiva, Pegue um primeiro tubo cônico de 50 mililitros e coloque um coador de células de cem mícrons estéreis sobre ele.
Passe a suspensão do cardiomiócito através do coador celular para remover quaisquer grandes pedaços de tecido. Por fim, lave o coador com solução stop para coletar restos de cardiomiócitos anexados. Centrifugar a suspensão da célula a 20 GS por três minutos e descartar o supernatante.
Suspender os cardiomiócitos e 10 mililitros de solução de parada, em intervalos de três minutos a 10 microlitadores de 100 milimilas de solução de cloreto de cálcio quatro vezes e misturar. Após a quarta edição, centrifufique a suspensão dos cardiomiócitos a 20 GS por três minutos e descarte o supernatante. Suspenda os cardiomiócitos na mídia cultural Pré emplaque as células em um prato de 60 milímetros e coloque na incubadora de CO2 por duas a três horas.
Em duas ou três horas. Os principais tipos de células contaminantes, como explosões de fibras, serão aderidos ao serviço do prato, permitindo o puro isolamento dos cardiomiócitos. Depois disso, tire o prato da incubadora e colete os cardiomiócitos flutuantes em um tubo cônico e reproduza os cardiomiócitos em uma placa de cultura revestida de laminina 24 bem.
Quatro a seis horas é suficiente para os cardiomiócitos aderirem à superfície. Assim, a transfecção poderia ser realizada seis horas após o revestimento. O reagente de transfecção RNA IMAX foi utilizado para transplantar cardiomiócitos com siRNAs.
A mídia cultural contém 25 sangues micromolar Staten complementado com 10% FBS, o que descobrimos ser mais adequado para realizar cultura de cardiomiócito de longo prazo e induzir análises de proliferação. Após a transfecção, você pode ver os cardiomiócitos utilizando uma micro incubadora para como estão as células para imagens de lapso de tempo. Estas são imagens de campo brilhante de cardiomiócitos em forma de vara transfeinada em baixa e alta ampliação.
Aqui, você pode ver imagens do dia a dia, que mostram alterações na morfologia cardiomiocócica do rato adulto. Confirmamos que os cardiomiócitos são saudáveis e contratuais em momentos iniciais, bem como após a diferenciação D e cultura de longo prazo. Aqui está um exemplo de coloração imunofluorescente Ki67 demonstrando proliferação induzida de cardiomiócitos adultos na cultura após siRNAs, uma transfecção.
Como você pode ver pelos resultados usando esta técnica, pode-se obter cardiomiócitos adultos saudáveis de camundongos e ratos e cultuá-los para estudo de longo prazo. Em conclusão, uma vez dominada essa técnica nos permitirá estudar cardiomiócitos muito além dos protocolos de cultivo atuais.
