该方法允许研究线粒体氧化还原状态在病理生理学条件下如何受到影响。它也可以用来评估旨在保护线粒体的治疗策略的有效性。这种技术的主要优点是，它允许对线粒体氧化还原状态的动态和动态变化进行器官和特异性评估。
该方法可以与附加指标相结合，以同时记录例如线粒体膜电位或除氧化还原状态外的钙浓度。该方案可应用于培养细胞、组织外植体和切片培养物。首先优化扫描共聚焦显微镜设置。
为此，请将检测器设置为12位或16位，激活顺序扫描模式并添加第二个序列/跟踪。对于这两个通道，选择指示曝光过度和曝光不足像素的伪彩色查找表，然后选择适合感兴趣对象的物镜。将带有细胞的盖玻片安装到成像室中。
加入一毫升成像缓冲液，并将腔室放在显微镜上。使用目镜和透射光聚焦细胞。记录具有不同像素格式和针孔大小的图像。
然后记录具有不同激光强度的图像，并相应地调整探测器增益和阈值。最后，记录具有不同扫描速度和不同帧数平均值的图像。对于实时成像，请将延时间隔设置为 30 秒，持续时间设置为 25 分钟。
然后安装细胞，将腔室放在显微镜上并如前所述聚焦细胞。切换到扫描模式，并使用实时视图中的 488 纳米通道对焦并定位细胞以进行成像。（可选）要增加每次运行记录的单元格数，请使用多点功能为每个盖玻片成像两到三个视场。
开始延时采集并记录五张图像作为两分钟的基线记录。向腔室中加入500微升3X NMDA溶液，以达到30微摩尔的最终浓度，并将另外20张图像记录为10分钟的NMDA响应。接下来，向腔室中加入500微升4X DA溶液，并再记录六张图像。
从成像室中吸出缓冲液，并用一毫升DTT溶液代替。再录制 10 张图像后，结束录制并保存图像系列。要导入图像分析软件中的数据，请单击插件，选择生物格式，然后选择生物格式导入程序。
在对话框中，选择视图堆栈中的超堆叠，将颜色模式设置为默认值，然后选择自动缩放。通过单击图像，选择类型，然后从选项中选择 32 位，将图像格式更改为 32 位。要将颜色通道拆分为单独的窗口，请单击图像，转到颜色，然后选择拆分通道。
调整阈值以选择要分析的线粒体，方法是单击图像，选择调整和阈值。在对话框中，选择默认的红色深色背景和堆栈直方图。当所选像素显示为红色时，单击应用。
然后选择将背景像素设置为NAN处理所有图像，并对通道二执行相同的过程。要可视化405到488纳米的比率，请单击过程和图像计算器创建比率图像。在对话框中，选择图像中的第一通道，在图像二中选择操作通道二中的一除法。
然后选择创建新窗口并处理所有图像。将比率图像的查找表更改为伪彩色，方法是单击图像，选择查找表，然后触发。为了分析图像，请在比例图像上的单个细胞或线粒体周围绘制ROI。
要将投资回报率添加到ROI管理器，请转到分析，单击工具，选择ROI管理器，单击添加并选择全部显示。要测量单个电池的405至488纳米比率，请单击ROI管理器，按Control A选择所有ROI，转到更多并选择多重测量。在对话框中，选择"测量所有切片"和"每个切片一行"。
将测量结果导出到电子表格软件后，选择405纳米图像，测量所有ROI的强度，然后再次将测量结果导出到电子表格软件。同样，测量488纳米图像的ROI强度。要保存投资回报率以供将来参考，请按控制条款A选择所有投资回报率，转至更多，然后选择保存。
这些来自延时记录的代表性快照显示了NMDA处理之前和之后以及使用DA和DTT进行最大/最小校准后的神经元的比例图像。用30微摩尔NMDA治疗神经元在几分钟内诱导线粒体氧化。对单个荧光通道的分析表明，NMDA诱导的线粒体酸中毒在405和488纳米激发时都会导致GFP荧光下降。
在对照实验中，用DA预处理排除了NMDA进一步的线粒体氧化。因此，尽管氧化还原敏感的GFP2荧光强度进行了相当大的淬灭，但405与488的比率没有改变。该实验证实，405至488纳米的比率不受pH值变化的影响。
在另一项实验中，并行评估了线粒体膜电位，氧化还原状态和形态。用60微摩尔NMDA治疗神经元导致四甲基罗丹明或TMRE信号的损失和405至488纳米rho GFP比值的增加，随后线粒体的一些延迟四舍五入。当您开始使用此方法时，花时间仔细优化微观设置非常重要。
这将有助于在实验过程中保持神经元的健康。始终遵守激光安全规则也非常重要。在现场录制期间添加药物进行篡改时，请确保不要暴露于激光辐射。
