הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

שמאי פרוטוקול נוכחיים בטקסטיל, שינויים במצב redox באופן תא תאי ספציפי. הפרוטוקול שלנו מאפשר הבנה וניטור טובים יותר של כל המנגנונים הפיזיולוגיים או הפתופיזיולוגיים של סטרס חמצוני. טכניקה זו מאפשרת כימות לא מפריע של יחס סולפיד העין הרעף בתאים שלמים באמצעות פלט מדד יחס כדי לאזן את ההבדלים בין רמות ביטוי האות, הלבנת תמונות, ורגישויות זיהוי.

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על אורגניזמים שונים, כולל חיידקים בצמחים. ביום הראשון של הניסוי לטפל בתאים מתוך קו תאים סרטן השד confluent במשך שתי דקות, עם שני מיליליטר של 0.2, 5% נסיעות EDTA. כאשר התאים מתחילים לנתק לעצור את התגובה עם שישה מיליליטר של בינוני מלא ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה.

להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של טרי, בינוני מלא, לספור את התאים לדלל אותם 1.5 פעמים 10 לתאים החמישי לכל מיליליטר אחד של מדיום שלם. ואז לזרוע 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של תאים ל הבאר בצלחת 6 באר, ולהחרים את התאים באינקובטור תרבות התא בן לילה. או לא להוסיף שום טרנסדוקציה GFP שורה ויראלית.

למחרת בבוקר, להוסיף 12.5, 25, ו 50 microliters של אחד עד 100 מדולל שש פעמים 10 כדי 10 לוחית 10 להרכיב יחידות למיליליטר של להוסיף שום פתרון GFP שחיקה ויראלי, במדיום מלא. הוסף את זה ל בארות המתאימות או לצלחת 6 באר כדי להתמר את התאים עם 50, 100, ו 200 כפל זיהום, בהתאמה. כאשר כל הבארים מדגם כבר מתמר עם וירוס, להחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 16 עד 24 שעות.

למחרת, לדמיין את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והחליף את supernatant עם בינוני, ללא וירוס כדי לאפשר לתאים להתאושש במשך 24 שעות נוספות. כדי לקבוע את יעילות ההעתקה האופטימלית, להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות והמורפולוגיה של התאים על ידי ציטומטריית זרימה. הקפד לנהל את כל ההליכים שיכולים לגרום לזיהום מתרסיסים או התזות בתוך ארון בטיחות ביולוגי מוסמך ברמה 2.

כדי להעריך את מצב redox של התאים, למחרת בבוקר, דגירה התאים ואת הבאר המתאימה של צלחת 6 באר עם 10 מי חמצן micromolar במשך שעה אחת, לפני ניתוק התאים עם 750 microliters של 0.2 5% טפטוף ב EDTA לגם, כפי שהוכח. לעצור את התגובה עם שני מיליליטר של מדיום שלם לגם ולמשוך את supernatants עבור כל מצב בודדים 15 צינורות חרוט מיליליטר. מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את כדורי ב 500 microliters של PBS היטב על ידי צנטריפוגות פעמיים.

לאחר הכביסה השנייה, לסנן את מתלי התא דרך 40 רשתות רשת מיקרו מטר לתוך צינורות תואמי cytometry זרימה על קרח, מוגן מפני אור. בתוכנת ציטומטר זרימה, להפעיל את ריבוי אפס של מדגם בקרת זיהום. ואז לנתח את מי חמצן ותאים מטופלים.

זה יאפשר חישוב של יחס עוצמת הפלואורסצנטי הממוצע בין הצורות מחומצן לעומת מופחת של GFP שורה, באמצעות הנוסחה כפי שצוין. להלן אסטרטגיית gating לבחירת מספר גדול של תאים לפי ציטומטריית זרימה מוצגת. ציטומטריית זרימה יכולה לשמש גם כדי לקבוע את עקומת תגובת המינון לניתוח GFP שורה ואת ריבוי היעיל ביותר של קלט זיהום.

על פי ריבוי הזיהום, עקומת תגובת המינון בניתוח מייצג זה, ריבוי של 200 זיהומים נתן את הביטוי GFP הכביש הגבוה ביותר, אבל מורפולוגיה התא היה תוצאה של ציטוטוקסיות. לכן, יעילות התמרה האופטימלית נקבעה להיות ריבוי של זיהום של 100. בניתוח מצב זה של חמצון מחדש, עוצמות פלואורסצנטיות של GFP משורה מחומצנות ומצומצמות התקבלו מניתוח ציטומטריית זרימה לרכב וארבעה 10 טיפולים במי חמצן בשליטה חיובית מיקרומולרית.

ההיסטוגרמות מכוסות מייצגות את השינויים במספר התא ב-10 מי חמצן מיקרומולריים וקבוצות מטופלות ברכב או GFP מופחת ומחמצן. חישוב היחס בין GFP שורה מחומצן ומופחת לניתוח זה גילה כי 10 מי חמצן micromolar גרם לעלייה משולשת חמצון של GFP שורה לעומת הטיפול ברכב. לאחר מספרי תאים מדויקים חשוב עבור חישובי MRI ושכפול.

על מנת לקבל תוצאות לשחזור, החוקרים צריכים לערבב ביסודיות את הפתרונות האנטי ויראליים כדי להשיג השעיות הומוגניות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור שינויים מהירים של redox כחלק בלתי נפרד מהמגוון הרחב של תהליכים תאיים נורמליים והתקדמות המחלה בזמן אמת.