使用 24 个井组织培养板 （EAgaL 板） 改进 了伊蚊 的丰度和生育率测定

这个程序使蚊子研究人员能够在个人层面上轻松地解决蚊子的生殖健康问题。与传统方法相比，该协议显著减少了在个人层面测试蚊子的生育能力和生育能力所需的时间、空间和人工。首先为渗漏实验准备盘子。

使用 1.6 毫米位的家用钻头，在 24 井培养板的盖子上每口井钻 4 到 6 个孔。实验前一天，在室温下清洗和冲洗盘子，将盘子浸泡在1%至5%的漂白剂中，浸泡30至60分钟。然后，在运行中的除离子水中彻底冲洗板并干燥。

将2%的蔗糖融化在除离子水中，并立即在24井板的每口井中加入500微升的熔融糖。将盘子放在实验室的长椅上过夜，以干燥任何凝结物。在喂血前至少16小时，从雌性蚊子身上去除任何水源或糖。

喂食当天，将水循环器加热至37摄氏度，用放置在人工喂食器中的脊椎动物血液喂养蚊子15至30分钟。然后，将蚊子转移到冰上的玻璃盘上。选择那些充满血液的容器，并把它们放入一个有30%蔗糖水的容器中。

女性至少需要72小时才能完成排泄和卵子发育。在将蚊子转移到24井板前约一小时，使用转移移液器将两到三滴水加入每口井中。用二氧化碳击倒蚊子，并把它们转移到冰上的玻璃盘上。

然后，将每只蚊子单独放在24井板的倒盖上。一旦所有24只蚊子被放置，用倒板底部盖住盖子，用新的橡皮筋固定盖住盖子，并将其放置在环境室中，直到蚊子恢复。然后，将盘子右侧向上转动。

允许雌性蚊子在24至48小时内渗出。然后，通过将雌性从盘子中释放到一个大笼子里来取出它们。在计算鸡蛋之前，检查每口井的鸡蛋在井壁上，在糖和塑料表面的边缘，他们很难在照片中解决。

使用湿画笔将这些鸡蛋移到平坦的表面，使所有鸡蛋均匀，并且不会相互重叠。使用钳子去除井中可能干扰成像卵的任何断腿、翅膀和其他颗粒。在显微镜模式下设置紧凑型数码相机，使用户能够聚焦在近一厘米的物体上，并拍摄每口井的图像。

拍摄每口盘子的油井后，拍摄整个盘子的图像。稍后使用成像订单标签来区分每个板。在每口井中加入大约五滴水，以防止其糖塞和卵子干燥，并诱导胚胎发育和孵化。

将图像传输到计算机，用板和井 ID 重命名文件，以便于组织。打开图像与图像J，并使用多点工具标记每个鸡蛋，放大或缩小，以计算鸡蛋团。标记所有鸡蛋后，双击多点图标以增加标记数并将结果记录在电子表格中。

一旦孵化出的幼虫出现，就开始向井中添加食物。大约五到八天后，用碎冰覆盖板15至20分钟，对幼虫进行麻醉。在板下插入黑色材料，以增强对比度，并在保持板在冰上的同时拍摄每口油井的图像。

拍摄完每口油井后，用成像顺序标签拍摄整个盘子的图像。打开图像J，并使用多点工具来计算幼虫。幼虫在形状、角度和焦点上可能有所不同。

不包括棚角质层，看起来像只有头部的幼虫与一点点的身体，或缩小的幼虫。在电子表格中记录结果。蚊子被注射双链RNA瞄准候选铁运输机，FeT，或控制基因EGFP。

然后，他们用鹰板法进行血液喂养和生育能力输出测量。沉默的铁运输机表达的蚊子在卵子数量和孵化率上都显著下降。沉默的蚊子也表现出延迟排泄物和小而浅色的鸡蛋。

拍摄好照片是这种方法的关键一步，因为单个卵子或幼虫的图片质量和数量直接影响结果的质量。