量化转基因 埃及伊蚊 的适应性成本

该协议展示了标准测量值，反映了埃及伊蚊的适应性，之所以选择这些适应性参数，是因为它们反映了繁殖成功，易于测量，并且通常在文献中报道。首先，将蛋纸放入无菌水中过夜，以孵化转基因和野生型蚊子。通过提供几滴磨碎的鱼食物浆液，让幼虫随意进食。

为确保成虫是处女，一旦蛹出现，就按性别将蛹分开，将蛹移至玻璃显微镜载玻片上，并用组织去除多余的水以固定蛹。在立体镜下以两倍到四倍的放大倍率，使用细尖的画笔，将蛹面朝上放置。然后目视分析尾巴的生殖叶形状差异。

将雄蛹和雌蛹放在适当的水杯中。为了将野生型或转基因基因驱动一个或基因驱动两个雄性与原始野生型雌性杂交，将麻醉蚊子以五雄一雌的比例加入含有约150只蚊子的蚊子盒中。两到三天后，在笼子上提供血源，按照标准的饲养方法喂养雌性。

通过目视筛查腹部肿胀情况，并将未喂养的部分、喂养和男性丢弃未喂养的女性，将血液喂养的女性与未喂养的女性进行分类。将充血的雌性放回各自的笼子里。两到三天后，将单个雌性放入 50 毫升锥形管中，内衬有用铅笔预先标记的滤纸。

用 5 毫升自来水填充所有管子。在每个锥形管上放一小块葡萄干或糖浸泡的棉球。将雌性留在 insectory 中一到两天，让它们产卵。

然后计算每张纸上的卵数并计算平均繁殖力，即每张纸上计算的卵数除以筛选的雌性数量。要干燥蛋纸，请从管子中排出水，然后将它们放回凹槽中。为了冷冻来自已完成的繁殖力研究中的血液喂养的雌性，将蚊子笼置于零下 20 摄氏度约 15 分钟。

解剖每只蚊子的左翼，切除翅膀和胸部的关节，并切除整个翅膀。使用镊子，将机翼平放在载玻片上，然后使用转移移液管将一滴包含70%乙醇和一滴洗洁精的15毫升储备溶液加入载玻片上的机翼中。接下来，在盖玻片中加入一滴 80% 甘油，然后将其放在机翼顶部的乙醇肥皂溶液中。

使用带有 65 毫米镜头的相机拍摄安装在载玻片上的机翼。使用 TpsDig 软件识别地标的二维笛卡尔坐标。使用手稿中提供的 R 脚本计算机翼长度和面积。

计算机翼质心大小，它是大小的量度，在统计上独立于形状，定义为每个标志从机翼孵化中心点的平方距离之和的平方根，从单个雌性收集的论文中将单个 F1 卵放入装有 100 毫升新鲜灭菌去离子水的聚丙烯透明熟食容器中。在孵化后两到三天，从水中取出蛋纸，让它们晾干过夜。在最初孵化的同一容器中重新孵化蛋纸。

在初次孵化后三到五天，目视检查幼虫是否有转基因标记。记录阳性或阴性转基因幼虫的数量。丢弃阴性幼虫。

生育率计算为转基因幼虫或对照幼虫的数量除以卵总数。要确定性别比例，请将每只成年雌性蚊子的雌性数量或在整个研究时间线上收集的雄性数量相加。将此数字除以为单个雌性产生的同一蚊子线收集的蛹数量。

为了确定幼虫的生存能力，将每只成年雌性蚊子在研究时间线上收集的蛹总数相加。将此数字除以先前计算的同一行中每只成年雌性蚊子所计算的幼虫数量。将幼虫到蛹发育计算为孵化后蛹发育的平均时间。

为了确定雄性的贡献，将 50 个转基因或对照雄性与 100 个对照雌性杂交到 64 盎司的纸箱中，这样就有 50 个雄性和 100 个雌性。交配后，按照标准的饲养方法，给蚊子提供血粉。然后将单个完全充血的雌性分离到50毫升锥形管中，内衬有预先标记的白色滤纸。

将雌性留在 insectory 中一到两天，让它们产卵。让纸张在管子中干燥至少五天。使用镊子取出纸张并放置它们进行孵化。

在孵化后两到三天，从水中取出蛋纸并让它们晾干。在相同的容器中重新孵化蛋纸。在初次孵化后三到五天，目视检查幼虫是否有转基因标记。

计算雄性贡献为F2转基因幼虫的数量除以每株蚊子品系的总幼虫数量。将 50 只雄性和 50 只雌性野生型或转基因年龄匹配的非血饲蚊子转移到适当的围栏内。追踪每天死亡的雄性和雌性蚊子数量。

将寿命计算为蚊子在笼子中死亡之前经过的平均天数，省略了因非信息原因而死亡的蚊子。幼虫到成虫的发育时间以及从蛹到成虫的发育时间通过Kruskal-Wallis'ANOVA和Dunn的事后比较进行评估。野生型雄性蚊子的化蛹时间短于野生型雌蚊，而D7L1雄性蚊子的化蛹时间与D7L1雌蚊相比无显著差异。

D7L1雌性比野生型雌性需要更长的时间才能化蛹，D7L1雄性也是如此，相对于野生型雄性。在蛹到成虫发育时间上，野生型和D7L1雌性无显著差异，野生型雄性化蛹速度快于野生型雌性和D7L1雄性。在研究期间，野生型雌性蚊子从未达到它们的中位生存时间。

所有其他组在 40 天之前达到他们的中位生存期，中位生存时间在时间上有明显的分离。D7L1敲除蚊子的翅膀面积明显小于野生型蚊子，但在翅膀或质心大小上没有差异。与希格斯宽眼线相比，携带一个基因驱动盒拷贝的蚊子在纳米或ZPG启动子的表达下没有显着差异，除了幼虫的生存能力。

这里收集的健身数据可用于下游应用，例如数学建模。对于评估新型遗传控制策略的研究，在本文概述的小技能适应性研究之后，有必要在半田间条件下进行更大规模的笼养研究。实验室中的适应性研究有助于识别基因敲除或敲入的意外影响。

敲除唾液蛋白可以诱导发育应激，而基因驱动一和二蚊子中的基因驱动显示出较低的幼虫存活率。测量基因驱动适应度强烈影响了其在数学建模后模拟群体的持久性。