使用荧光染料，罗达明B，研究雄性 伊蚊 的交配竞争力

该协议衡量雄性蚊子交配的竞争力，这是男性释放蚊子种群抑制计划的先决条件。此健身标准作为质量控制和菌株评估的一部分进行评估。这种方法可将实验时间缩短90%，并允许直接比较两条无菌或沃尔巴契亚感染线之间的交配竞争力。

执行此程序的将是艾琳·李和吴伟马克。首先，根据蚊子的大小差异，在幼虫阶段对雄性蚊子进行。每组蚊子，将100只雄性幼虫转移到预先标记的笼子中，用于蔗糖喂养或罗达明B蔗糖喂养。

将雌性幼崽分小批量放入每笼40至50只。伊马戈人出现后，检查笼子是否有雄性蚊子。要准备 0.2% 罗达明 B 蔗糖溶液，每 100 毫升 10% 蔗糖溶液溶解 200 毫克罗达明 B 粉末。

混合好，以确保所有的粉末溶解。准备20个含糖的糖喂食瓶和一个芯子。将 10 毫升 10% 蔗糖加入 10 个喂食瓶中，为其他 10 个喂食瓶添加 10 毫升 0.2% 罗达明 B 蔗糖溶液。

将五个喂食瓶放入每个准备好的雄性笼子中，让雄性蚊子在交配实验前喂食三天。打开汞燃烧器灯和立体显微镜。让汞燃烧灯的光源稳定10分钟。

然后设置红色荧光蛋白的荧光过滤器。一次将少量蚊子吸进口腔吸气器的玻璃管中。通过玻璃管，在荧光立体显微镜下观察雄性蚊子的身体。

实验只使用标有罗达明B的雄性蚊子。转移集 雄性蚊子放入12个纸杯中，用网固定。将每杯10只蔗糖喂养的雄性蚊子放入6杯中，将每杯10只罗达明B蔗糖喂给雄性蚊子放入其他6杯。

重复此步骤设置 B 雄性蚊子。设置 12 个笼子进行交配分析。在6个笼子中，每只都包括10组标有罗丹B标记的A型雄性蚊子，10只未标记的B型雄性蚊子，以及10只处女野生型雌性蚊子。

在其他6个笼子中，包括10只未标记的A型雄性蚊子、10只罗丹B型B型雄性蚊子和10只处女野生型雌性蚊子。标记这些笼子，以清楚地区分两个交配组合。根据标签将各自的雄性杯子放在交配笼中。

取下网，轻轻敲击杯子，将雄性从杯子中挤出。小心地从笼子里取出纸杯和网，确保没有蚊子从笼子里逃出来。让雄性蚊子在交配笼中适应至少一个小时。

使用口服吸气器，将处女野生型雌性蚊子转移到12个纸杯中，每个纸杯内含有10只蚊子。雄性蚊子的适应期结束后，将一杯雌性蚊子转移到每个交配笼中，并取出网。轻轻地将杯子挤出，鼓励剩余的雌性蚊子离开杯子，然后小心地从笼子里取出纸杯和网，以确保没有蚊子从笼子里逃出。

允许交配进行三个小时，然后用机械吸气器将所有蚊子从每个笼子中取出，从而终止交配实验。冷麻醉在冰上的蚊子至少五分钟。当蚊子完全麻醉时，轻轻地捡起雌性蚊子，放在一个单独的纸杯里，用网固定。

将各自的标签从交配笼转移到杯子上，从而标记纸杯。为了给雌性精子打分，在立体显微镜下解剖之前，在冰上对雌性蚊子进行至少五分钟的冷麻醉。在立体显微镜下解剖雌性蚊子。

在显微镜下检查精子。如果女性没有授精，所有三个精子都将是空的，如果授精，两到三个精子将充满运动精子。对于受精个体，通过在装有RFP1过滤器的荧光立体显微镜下检查，确定精子是否含有含有罗丹B标记的开创性液体。

如果精子中充满了未标有罗达明B的开创性液体，则不观察到荧光。另一方面，如果精子中含有罗达明B标记的开创性液体，它会荧光橙色。这种交配竞争力测定的目的是确定经过几代近亲繁殖后，男配体能是否会下降。

进行了交配竞争力检测的实验三重切片，授精数据显示于此。野生型雌性由近亲繁殖或外生雄性授精，具有互惠标记。结果表明，近亲繁殖或异雄性受精的女性比例不受罗达明 B 标记的影响。

与外向雄配的女性比例明显高于所有三个复制体中的近亲繁殖雄性，这表明近亲繁殖可能导致交配体能下降。准备额外的雌性蚊子笼子很重要。不要使用被雄性蚊子污染的笼子里的女性蚊子，因为受精前的女性会使所有数据无效。

除了基于实验室的交配竞争力分析外，该程序可用于标记释放-捕获实验，以研究昆虫交配生物学、种群动态及其分散性。