我们的自动化 cPILOT 协议使研究人员能够更轻松地以高吞吐量的方式分析样品。这一点很重要，因为它使我们能够更快地获得有关疾病或不同条件的生物信息。此技术的主要优点是，它有助于并行处理多个样本，从而减少可操作的错误，同时使用高吞吐量样本。
我们的实验室对与衰老和阿尔茨海默病相关的应用感兴趣。然而，这种技术也可以用来研究任何疾病或挑战，哪里涉及生物组织。首先打开正压装置、加热和冷却装置以及真空泵。
将所有附件与液体处理器连接，一旦连接到计算机并准备好操作，该处理程序将显示蓝光。肝脏的Aliquot 300微升均匀质化成500微升管，并放在两毫升深井板上。将样品存放在摄氏四度，直到协议开始。
在软件中打开方法，将所需的提示和实验室软件放入其位置。然后与最终的卡片组布局交叉检查，然后单击"下一步"以继续协议。从储层装载 230 微升尖端，并吸入 90 微升的 8 个摩尔尿素。
然后分配到一排黑色两毫升深井板。卸载 TL1 的尖端并重复此步骤，直到尿素已添加到所有孔中。添加变性缓冲液后，使用90微升尖端将10微升小鼠肝脏均质质转移到深井板。
卸载尖端，然后加载一排 90 微升尖端，从试剂板一中吸气三微升 DTT。将 DTT 分配到深井板的第一行和第二行。用铝箔密封样品板，并在 37 摄氏度下孵育 600 秒，同时以 300 RPM 旋转。
孵育后，加载一排90微升的吸头，从第三排的试剂板中吸出6微升IAM，然后分配到一排样品板。密封样品板，并在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，同时在冷却设备上以 300 RPM 转速旋转。然后解封样品板，并加载一排 90 微升尖端。
从试剂板一排第二排吸出五微升的半胱氨酸，然后分配到样品板的第一排和二排。在室温下孵育板30分钟。孵育后，执行1800 RPM的时时摇动30分钟。
然后加入800微升20毫摩尔三叶草缓冲液，在样品板上的每一个井中加入10毫摩尔氯化钙，将尿素浓度稀释至两个摩尔。将 20 微升的 trypsin 添加到 96 井板的第一排，并将板放在甲板上的指定位置。将 trypsin 添加到样品板后，在加热和冷却装置上密封并孵育 15 小时，温度为 37 摄氏度和 600 RPM。
从甲酸板第三行吸入150微升5%甲酸，并分配到第一排和第二行的样品板，停止消化。继续脱盐肽。使用 1070 微升提示吸气 600 微升的乙酰三叶草。
然后将实相萃取（SPE 板）的第一行和第二行分配，以激活 C-18。接下来，将消化的样品两次加载到 SPE 板上。加载两排吸头，吸进 534 微升的消化样品，然后将它们分配到 SPE 板的第一行和第二行。
向板施加压力，然后重复此步骤，直到加载所有样品。通过用水清洗多肽，用 0.1% 的甲酸稀释 60 至 40 乙酰三叶酸。然后将板放在收集板的顶部，使用正压装置对肽进行分管。
向下绘制流式处理并设置软件中所需的提示和实验室软件，与甲板布局交叉检查，然后单击"下一步"以继续二甲基化协议。在1%醋酸中重组肽。为了执行二甲基化标签，从第二排试剂板二中装载90微升尖端，吸制16微升60毫摩尔光甲醛。
将它分配到一个样品板行，然后卸载尖端。从试剂板第三排装载一排90微升尖端，吸气16微升60毫摩尔重甲醛。分配样品板的第二行并卸载尖端。
从试剂板第三行第一排和二排装载两排90微升尖端，吸气16微升24毫摩尔氰氨化钠和24毫摩尔氰硅二甲二甲酸酯钠，然后将试剂分配到样品板第一排和二排，开始二甲基化反应。卸载尖端并使用轨道摇床在 1800 RPM 下执行 15 分钟的时分抖动。然后从试剂板三行第三排和四排装载两排 90 微升尖端，从试剂板三中吸入 32 微升 1%氨气。
将样品板二排第一行和二排分配，以停止反应。将同等体积的轻质和重二甲基多肽组合到新的两毫升深井板中，用于脱盐。脱盐组合的轻质和重肽后，干燥肽并执行等性标记。
在轨道摇床上用100微升100毫摩尔三乙基碳酸氢基化合物缓冲液重建肽。然后使用 90 微升尖端吸气 25 微升组合的二甲基多肽，并将它们分配到 TMT 加工板的第一排。加载一排 90 微升尖端，并吸入 10 微升 TMT。
在 TMT 加工板的第一行中分配，卸载尖端，然后在 1800 RPM 下执行一小时的时分摇动。从 TEAB 板第二排吸入八微升羟基胺，并分配到 TMT 加工板的一排。在 1800 RPM 下摇动 15 分钟后，将 TMT 标记的肽的 30.5 微升转移到 1.5 毫升管中。
然后根据手稿指示进行数据采集和分析。此处显示了来自 22 Plex 组合前体同位素标记和同位素标记实验的所有 22 个记者离子通道中识别的肽的代表性 MS 数据。肽的序列对应于β氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶。
轻和重二甲基化峰最强烈的碎片离子被进一步分离为MS3碎片。记者离子强度与样品中的肽丰度成正比。总体而言，这种组合的前体同位素标记和同位素标记实验缩短了样品处理时间，并使得在多个通道或条件下可视化蛋白质表达成为可能。
所有 22 个通道的日志 10 丰度与总记录器离子强度的框图显示的井间或样本间变异性较小。通过检查22个样本中每种蛋白质中报告离子丰度误差，对完全自动化进行了评估。使用机器人平台进行样品处理，导致变化系数非常低。
在3098肽中，轻二甲基多肽的平均离子丰度变化系数为12.36%和15.03%。在尝试此协议时，必须记住同位素和同位素水平在单个实验中使用。因此，需要执行仔细的规划，以指定每个样本与拟在实验中使用的标记。
这种方法可以很容易地集成到其他机器人系统中，并可以应用于各种组织，如组织或细胞利沙酸盐和其他生物流体。
