该协议意义重大，因为多路复用免疫荧光协议的发展优化和转移是复杂和具有挑战性的。对于许多实验室来说，优化协议是无价的。多光谱免疫荧光使我们能够评估肿瘤内和周围多种细胞类型的位置和标识。
这是免疫肿瘤学研究中信息的有力组合。多路复用免疫荧光最吸引人的用途是免疫肿瘤学。但是，在所有自身免疫和炎症疗法中，都可以利用对 setu 中的多种免疫细胞类型进行测量。
了解实体细胞内和周围免疫细胞的位置和表型是肿瘤特异性免疫疗法的预后和可预测的反应。协议的优化和验证是不应仓促执行的关键步骤。新的开发人员应该熟悉与多光谱成像相关的新型伪影。
要定位基本多丛协议，请在自动染色器上预加载。在协议屏幕上筛选所有"而不是首选"。在进行更改之前，请保存原始协议并单击协议选项卡，右键单击 Opal 6 多路复用以选择复制。
在新窗口中将名称更改为 7 多路复用协议 1'，然后选择与正确设备关联的选项卡。匹配补充表S1'中的协议，然后单击添加试剂以添加十分钟的帕罗西德抑制步骤，选择过氧化物酶抑制剂作为试剂。确认阻断步骤利用蛋白质激酶抑制剂阻断缓冲液，每个初级抗体引用适当的试剂，二次抗体步骤利用马萝卜过氧化物酶聚合物，并利用多光谱自动化套件提供的光谱达皮。
确保协议包含过氧化物酶抑制剂，然后连续进行六次染色，每个染色过程包含蛋白质阻塞步骤、一级抗体、二次抗体、酪酰胺底，然后提取抗原去除抗体。要添加放置控件，请复制 7 多路复用协议 1'name，并将其更改为 7 多路复用协议 1 CD68 删除。将 CD68 防身体试剂更改为鼠标 IgG 并保存协议。
然后，再创建六个新协议，每个放置控件一个，以相同方式为完整的等值型控件创建一个。以与此处显示的方式相同，为每个目标制定一个放置控制协议。要准备研究检测套件，请用 1X 三缓冲盐水填充标有 1X 三分缓冲盐水的 30 毫升开放容器，然后将容器放在离多路复用研究套件 1 手柄最远的位置。
标记两个 30 毫升的开放式容器 muli 光谱块和多光谱二次，并在多光谱染色套件中填充 30 毫升的阻断缓冲缓冲抗体稀释剂的突变光谱块容器。在多光谱二次容器中加入来自多光谱染色套件的30毫升抗老鼠抗狂犬病二次抗体聚合物，并在10个7毫升的开放式容器中加入600微升抗体稀释剂。接下来，将浓缩原抗体添加到表中指示的体积中的适当管中，然后通过温和移液混合。
将 3 毫升双蒸馏水加入 3 毫升双蒸馏水，再加入 12 滴光谱达皮，放入一个 7 毫升的开放式容器中，将 3 毫升过氧化物酶块加入第二个 7 毫升的开放式容器中。用 75 微升二甲基硫化物重新悬挂每个硫化地板，然后通过移液混合。然后，将Tyramide信号放大地板库存储存在4摄氏度，直到准备就绪。
在准备单个 TSA 地板稀释时。将自动染色器上的所有试剂注册，然后将每个容器放入试剂架中，然后将所有试剂装载到自动染色器上。染色剂将检测是否存在并确认每种试剂的体积。
加载所有试剂后，激活协议，在一夜之间运行。在染色过程结束时，将样品装上盖板，然后将样品装入多光谱成像平台扫描仪进行扫描。扫描所有示例后，图像将格式化为 qptiff 文件。
打开一个合适的 qptiff 分析软件程序，然后单击加载幻灯片'打开一个五个过滤器整个幻灯片扫描感兴趣的幻灯片。登录并使用图章工具选择五个区域进行多光谱成像。在"选择：选择"在字段中的"大小"下选择"获取"：选择 1x1，在"字段分辨率"下选择 0.5 微米 20 倍。
基于此细胞蛋白染色选择几个区域与细胞蛋白阳性肿瘤组织，和细胞蛋白负频闪组织从整体扫描图像。选择所有多光谱图像后，切换到 Vectra 软件，并更改每张幻灯片的任务从扫描到多光谱成像。然后，单击扫描以执行多光谱成像集合。
多光谱图像采集完成后，使用频谱非混合软件在多光谱图像文件夹中打开文件。在图像格式下"选择多光谱""在样本格式下"选择荧光"，在光谱库源下选择"选择""选择楼层"，选择并加载所有六层，从样本库幻灯片中选择并加载所有楼层，然后单击"全部准备"。频谱非混合软件将使用提供的光谱配置文件对所有打开的图像执行光谱解混合。
识别和注释自动荧光光谱轮廓。请务必检查自动荧光功能，以确保在取消混合后在自动荧光通道中完全捕获该功能，并测试不同的采样，直到其被接受删除。然后与病理学家一起，在相同组织的连续幻灯片中，根据同一目标的色度单染色图案评估染色模式。
要评估每个通道的荧光强度，请使用计数工具测量打开的图像。然后，返回到染色协议，并调整 TSA 浓度，以解决任何超过或未达到可接受的范围的规范化计数。在这个代表性的分析中，扁桃体组织在扁桃体表面表现出一种明确界定的细胞甲酸染色，在淋巴组织中没有背景的鳞状上皮，在冷冻的上皮中明显有细胞蛋白和PDL-1染色。
卵泡细菌中心很容易识别，富含Ki-67阳性淋巴细胞。细菌中心内存在的巨噬细胞由其CD-68表达识别，在细菌中心外也观察到一些巨噬细胞。CD-8染色淋巴细胞与T细胞分布和PD-1表达强烈染色的小淋巴细胞聚集在细菌中心的边缘，以及分散在整个泡间区域。
在扁桃体组织控制中确认预期的染色模式后，可以在肺癌样本中评估相同的染色。还应评估等型负控制和下降控制;不仅用于检测背景和自动荧光，而且用于伞效应和光谱出血。在优化新的多丛面板期间，由于采用多丛免疫荧光法，跌落控制对于评估染色中的潜在伪影非常重要。
每个滴对应显示与全多丛面板相同的染色模式，但每个特定控制上应去除的单一原抗体除外。具有多光谱免疫荧光的免疫分析允许通过免疫标准对肿瘤和区域进行分层，然后可以通过大规模多路复用基因组、转录和蛋白质组研究来研究。我使用多丛免疫荧光来研究肿瘤学和自身免疫性疾病的行动机制，从而在 setu 的单个部分识别和鉴定免疫和致病细胞。
当使用抗体对人蛋白、泰拉米德和达皮时，应采取一般预防措施，但本协议中没有任何试剂或材料特别危险。
