从多重条形码图像分析中获得的大量生物学信息使科学家能够更好地了解肿瘤微环境，以及肿瘤细胞内的特殊分布。这种方法的主要优点是，它为我们提供了来自同一组织样本的更详细的信息，并有可能对单个细胞进行更深入的表型分析。这种方法使可定制的面板能够研究肿瘤微环境，以潜在地发现癌症组织中的预测生物标志物，以用作新的靶点治疗。
要开始寡核苷酸偶联抗体染色，请将盖玻片在室温下浸泡在0.1%聚-L-赖氨酸溶液中24小时，以准备组织放置和粘附。排出聚-L-赖氨酸溶液后，用超纯水清洗盖玻片30秒。洗涤后，从超纯水中取出盖玻片，并将它们放在不起毛的毛巾上晾干过夜。
将5微米厚的感兴趣组织切片放在带聚-L-赖氨酸的盖玻片的中心，并让它们干燥过夜。在烤箱中将盖玻片支架在 60 摄氏度下预热过夜。将包含组织切片的盖玻片放入预热支架中。
在 60 摄氏度下烘烤 30 分钟后，检查以确保石蜡已从组织中融化。快速将装有样品的盖玻片支架依次放入一系列溶液中。最后，将盖玻片支架放入DEPC处理的超纯水中两轮，每轮五分钟。
通过将浸水的纸巾放在空移液器吸头盒的底部来准备湿度室。在压力锅中装满水，足以覆盖 50 毫升烧杯高度的一半。将每个样品5毫升甲醇放入4摄氏度的烧杯中。
用焦碳酸二乙酯或DEPC处理的超纯水将所需体积的AR9缓冲液稀释至1X。接下来，在 50 毫升玻璃烧杯中加入约 40 毫升稀释的 AR9 缓冲液。将样品浸入烧杯的盖玻片支架中，并用铝箔完全覆盖烧杯。
将铝箔覆盖的烧杯放入装满水的压力锅中，以约 15 PSI 的速度煮 20 分钟。然后取下烧杯，小心地打开铝箔。让烧杯在室温下冷却约 10 分钟。
从1X AR9缓冲液中取出盖玻片支架。在DEPC处理的超纯水中孵育两次两分钟。同时，从多重成像染色试剂盒中取出水合缓冲液、抗体稀释剂和封闭溶液 N、G、J 和 S。
将盖玻片样品放入5毫升水合缓冲液中两次，每次两分钟。然后将盖玻片样品放入5毫升多重成像抗体稀释剂块中，并在室温下孵育20至30分钟。在孵育期间，准备抗体混合物。
孵育后，将盖玻片放入先前准备好的湿度室中。将190微升抗体混合物移液到盖玻片样品上，并在室温下孵育3小时。接下来，洗涤样品两次，每次用5毫升多重成像抗体稀释剂块洗涤两分钟。
为了将结合的抗体固定到组织上，将盖玻片在用储存溶液稀释至1.6%的16%甲醛中孵育10分钟，并用PBS洗涤三次。将盖玻片在甲醇中孵育五分钟后，预冷至4摄氏度。洗涤后，将盖玻片再次孵育20分钟，在5毫升用PBS稀释的固定试剂中，并在储存前用PBS洗涤三次。
按照文中提到的成分准备报告预混液。在96孔板中填充245微升含有报告预混液和该实验周期的特定条形码荧光团的溶液中的孔。该图显示了此处用于癌面板的报告板配置。
为了保护条形码荧光团，请在 96 孔报告板上粘上箔板盖，并将板放置在多重成像仪器内。通过将样品盖玻片放在显微镜载物台上并手动将 700 微升 1：1500 滴定的核染色溶液移液移液到组织上，使用 DAPI 通道校准成像焦点。要制备多重成像仪器，请使用DEPC处理的超纯水将10X多重成像缓冲液稀释至1X，并用适当的溶液或溶剂填充试剂瓶。
设置所有显微镜参数，并在样品盖玻片上选择要成像的感兴趣区域。将实验设计输入仪器管理器软件。单击控制软件中的“实验”按钮，然后在“实验设置和管理”窗口中，单击“新建模板”按钮。
在“项目”按钮旁边的空白处键入项目名称，然后输入总周期数。单击“通道分配”按钮，在列中键入每个循环的信息，例如正确的循环、孔号、Z 堆栈位置、标记名称、类别和每个循环的曝光时间。然后，通过单击“开始实验”开始实验，并保存实验。
单击计算机上的QuPath图标，然后打开软件。将 qptiff 文件拖到查看器窗口中。单击亮度和对比度按钮以打开亮度对比度窗口。
选中或取消选中所选列中的标记以显示或隐藏标记信号。单击缩放以适合按钮以放大或缩小感兴趣区域。当使用图像分析软件查看时，合成图像根据需要显示所有标记或选定的标记。
揭示了所有标记的信号强度、动态范围和空间分布。该技术允许在单个组织切片中分析亚细胞水平上的所有26个标记物。遵循多重图像分析过程，通过信息学方法可以处理和分析高维单细胞数据，以推断生物学和临床洞察力。
多重条形码图像分析是一种强大的方法，使科学家能够分析肿瘤组织并根据面板中的标记回答他们的研究问题。
