这种方法可以回答干细胞和癌症领域的关键问题，如干细胞异质性的外观以及如何分离敏感癌细胞的治疗。本研究的主要优点是，它结合了技术上强大的单细胞基因表达分析与疫苗病，以进一步下游对目标亚细胞的表征。虽然这种方法可以用来研究癌症和干细胞异质性，但它也可以提供基因启动和血统潜力的见解。
要开始协议， 在无 RNA/DNA 的长椅上，通过混合 390 微升核酸酶无核酸酶、17 微升 10%NP-40、2.8 微升 10 毫摩尔 dNTP、10 微升 0.1 摩尔 DTT 和 5.3 微升 RNAse 抑制剂，为 96 孔准备足够的解合缓冲液，额外增加 10%。漩涡和旋转下管。接下来，将四微升的解液缓冲液分发到 96 孔 PCR 板的每个孔中，用粘合膜密封板。
向下旋转板以收集底部的液体。将盘子放在冰上，直到细胞分拣最多24小时。一旦 FACS 机器正确设置，通过将至少 100 个目标细胞分类到具有 100 微升染色缓冲液的新微离心管中，对目标群体进行重新分析。
FACS 通过记录已排序的样本来分析已排序的单元格，并确保它们最终进入排序门。然后通过将 96 井板中井 A1 的落点居中，设置单单元板排序。居中时，在空的96孔板边缘的所有井中对50至106微米的颗粒进行排序，以确保所有孔在每个孔的中心都有一个细胞。
从板上取下粘合膜。将林-CD34加CD38减去细胞的单个细胞分拣成96口井中的92个。在 FACS 排序软件中激活索引排序，保存 CD45RA、CD49F 和 CD90 的每个单元的免疫表型配置文件。
分别对两个带 10 个和 20 个细胞的孔进行排序，以在 PCR 放大中进行线性控制。通常使用井 H1 和 H2。保持两个井没有任何细胞，因为没有任何模板控制，通常井H3和H4。用透明胶粘膜密封板，并在重力 300 倍时旋转板一分钟。
将盘子扣在干冰上。然后将它们储存在零下80摄氏度。通过添加 632.5 微升两次反应混合、101.2 微升 Taq/上标三、151.8 微升底转组合和 0.7 微升在控制RNA中尖峰，进行逆转录和特定目标放大混合。
漩涡溶液，并旋转下来收集管底的液体。将混合物放在冰上，直到准备好添加到样品中。接下来，解冻冰上的落酸板。
将先前准备的逆转录和特定目标放大混合物的8.75微升添加到92孔中，包括线性和无模板控制。在其余四口井中加入8.75微升无逆转录控制混合物。然后用透明胶膜密封板，然后旋转板，在底部收集液体。
根据前置程序在PCR机中运行板，执行逆转录和特定目标放大。通过将三个微升的测定装载试剂移液到 96 井板的每个井中，准备测定装载板。在测定装载板中，将每个底料的三微升添加到单独的孔中。
用胶粘膜密封板并旋转下来。旋转板后，将8微升无核酸水移液到96孔板的所有井中，准备稀释板。在稀释板中加入两个微升放大样品。
用胶粘膜密封板。通过旋转板 10 秒钟混合。然后旋转板。
接下来，通过仔细将 352 微升主混合与 35.2 微升样品加载试剂混合，准备样品加载混合物。通过将 3.3 微升的装载混合物等到 96 井板的每个井中，准备样品装载板。将稀释样品中的 2.7 微升添加到样品装载板的每个井中。
用胶粘膜密封板并旋转下来。拿出一个新的96由96微流体芯片。用带帽子的注射器戳进口，以确保它们可以移动。
将注射器的全部体积添加到每个阀中，同时将芯片倾斜到 45 度并按下阀门。使用 IFC 控制器为芯片提供上位。从检测装载板的每个孔中用 4.25 微升加载每个检测入口，避免气泡。
如果井中出现气泡，请用移液器尖端将其拆下。继续用样品装载板中每个孔的 4.25 微升加载每个样品入口，避免气泡，如果出现气泡，则用移液器尖端将其清除。使用集成流体电路控制器或 IFC 控制器加载芯片。
检查芯片看起来看起来均匀，以及所有腔室都已加载。用胶带接触芯片表面的灰尘。最后，在多路复用微流体基因表达平台上运行芯片。
成功运行的热图显示样本中均匀分布的表达式，其强信号约为 7 到 25 CTs。这种控制RNA尖峰的放大曲线验证所有孔的清晰表达在10 CT左右，几乎没有变化，验证了所有细胞的扩增前和qPCR反应是否成功。原理成分分析或PCA，使用尺寸减少来可视化细胞组之间的相似性，可以有助于区分分子上不同的细胞群群，在这里识别四个子群。
要识别不同分子簇细胞的免疫性，请将索引FCS文件加载到 FlowJo 中。打开脚本编辑器并粘贴索引脚本，按"运行"。每个单元格现在将分一个门。
将每个单元格添加到布局编辑器中，并根据文件中可用的 SCXV 分子定义的分组为它们sample_complete_data.xls。FACS图显示了造血干细胞标记CD90和CD45RA的细胞表面标记表达，可用于区分聚类并分离它们进行功能分析。按照这个程序，可以执行其他技术，如新发现的亚细胞的RNA测序或体外和体内实验，以回答其他问题，如什么分子机制导致这种异质性，以及亚细胞在功能上有何不同。
这一策略为研究人员不仅研究正常和恶性造血的异质性铺平了道路，还可用于潜在地分离发现的亚体，以进一步研究它们。
