פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של Vivo Two-Photon כדי לבצע הדמיה חוזרת של הדינמיקה התאית, באותו מיקום מוחי לאורך פרקי זמן ממושכים. היתרון של טכניקה זו הוא, זה מאפשר לדמיין את השינויים לטווח ארוך באלמנטים הסלולר של המוח, כולל הסדר, מורפולוגיה, אינטראקציות פיזיות בין סוג תאים שונים של CNS. טכניקה זו יכולה להיות שימושית במיוחד בהגייה של אינטראקציות בין תאים לתאים, דינמיקת תאים ושינויים מורפולוגיים במהלך פלסטיות המוח, ונוירוזנרציה.
התחל על ידי הכנת צעיר או מבוגר צעיר, בן ארבעה עד 10 שבועות, עכבר הטרוזיגוטה GFP CX3CR1, ששוקל 17 עד 25 גרם, להשתלת חלון גולגולתי. לאחר הרדמה של העכבר, השתמש גוזם שיער כדי לגלח את השיער על ראשו, בין האוזניים, בערך, מן העיניים, לראש אזור הצוואר. הזיזו את העכבר לתחנת הניתוח הסטריאוטטית, חרוט האף וייצבו את ראשו באמצעות פסי אוזניים.
שמור על העכבר על משטח החימום, לאורך כל ההליך. שימון את שתי העיניים עם משחת שמן, ולאחר מכן להזריק 100 microliters של 0.25%bupivacaine, ו 100 microliters של ארבעה מיליגרם למיליליטר dexamethasone, תת עורית באתר החתך. המתן לפחות חמש דקות לפני שתמשיך.
לדמם את הראש מגולח, עם שלוש ספוגיות לסירוגין של betadine, ו 70% אלכוהול. ואז לעשות חתך הקרקפת קו האמצע עם להב כירורגי או מספריים. המשתרע מהגב של אזור הגולגולת, בין האוזניים, לאזור הקדמי בין העיניים.
חותכים את העור הנותר כדי לחשוף את הגולגולת. לדמם את רקמת החיבור הממוקם בין הקרקפת לבין הגולגולת הבסיסית עם 3%מי חמצן, ולמקם את אזור המוח כדי להיות בתמונה עם קואורדינטות סטראוטקטיות. לקדוח פתח עגול, כארבעה מילימטרים לתוך הגולגולת, באמצעות קצת מקדחה שיניים.
במהלך הקידוח, הרים באופן קבוע את הגולגולת עם מלוחים סטריליים מטליות כותנה כדי לקרר את המוח. לנקות את פסולת העצם, ולרכך את עצם הגולגולת. בסיום, הסר בזהירות חלק זה של הגולגולת עם מדפים מחודדים.
לאחר הסרת הגולגולת, מניחים בזהירות כיסוי קטנה, לחה עם מלוחים בגולגולת. יש לייבש את התמיסת מלח העודפת באמצעות מגבון סטרילי. באמצעות מוליך מחודד, להחיל דבק cyanoacrylate סביב החלון, ולאפשר לו לצרף למוח ולגולגולת.
החל את הדבק פריימר על שאר הגולגולת, לרפא אותו עם אור ריפוי במשך 20 עד 40 שניות. ליצור באר סביב החלון עם הדבק הסופי, לרפא אותו עם אור ריפוי במשך 20 עד 40 שניות. הדבק צלחת ראש קטנה על הגולגולת, על חצי הכדור ההפוך, craniotomy, עם הדבק פריימר, ולאחר מכן עם הדבק הסופי, ריפוי שניהם במשך 20 עד 40 שניות.
לאחר שהעכבר מתעורר, להזריק מנה תת עורית אחת של buprenorphine SR כמו משכך כאבים לאחר הניתוח, אשר יהיה מספיק במשך 72 שעות. להחיות את העכבר עם מזון מלח נוסף כדי להקל על התאוששות בריאה. הדמיה יכולה להתבצע כבר שבועיים לאחר ניתוח ההשתלה.
השתמש ברגים כדי להרכיב את צלחת הראש על שלב מיקרוסקופ שני פוטון, אשר צריך להישמר ב 35 מעלות צלזיוס עם צלחת חימום. להזריק את העכבר תת עורית עם 100 microliters של צבע כלי הדם, כגון רודמין B.Gently לנקות את פני השטח של החלון הגולגולתי עם ספוגית כותנה, dabbed ב 70% אתנול. שים כמה טיפות מים או מלוחים על החלון, ולהוריד את העדשה האובייקטיבית לתוך הפתרון.
ודא שהלייזר כבוי כשהמטרה יורדת, וצייר מפת קורסים כדי לציין את ציוני הדרך העיקריים של כלי הדם, תוך כדי התבוננות דרך העינית. השתמש בציור זה כדי לזהות את האזורים הספציפיים במהלך דימות שני פוטונים. לאסוף תמונות של תאים פלואורסצנטיים וכלי באמצעות הדמיה שני פוטון.
עיין בכתב היד של הטקסט לקבלת פרמטרי הדמיה, רשום הערות זהירות עם קואורדינטות מתאימות, כדי להבטיח שניתן יהיה לבקר מחדש את האזורים המדויקים להדמיה עוקבת. צייר כמו כמה שדות מבט במפגש הדמיה ראשוני זה, בסוף ההדמיה, להוריד את העכבר מהבמה, לאפשר לו להתעורר מהרדמה, ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלו. השתמש בהערות ובתמונות שהושגו כדי לדמיין מחדש את האזורים במהלך ההפעלות הבאות.
פרוטוקול זה שימש כדי לדמיין דינמיקה מיקרוגליאלית ב Vivo, בעכברי קו YFP-H טייוואן. דנדריטים ספציפיים, שימשו כציוני דרך יציבים למיפוי עדין של אזורי מוח. בעוד דנדריטים הם יציבים, כמה microglia לנוע מדי יום.
עכברי CX3CR1/GFP מהופנטים יחידים, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה במשך עד שמונה שבועות. זריקות של רודמין B, שימשו כדי לתייג את כלי הדם, במהלך כל מפגש הדמיה. בעוד כלי הדם נשאר קבועים באופן קבוע, המיקרוגליה דינמית.
עכברי CX3CR1/GFP, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה לפני ואחרי התקפים חמורים. מבנה מיטת כלי הדם נשמר, אך הרשת הסלולרית המיקרוגליאלית ונוף המיקום היו ארעיים. שינויים גדולים יותר נצפו בתוך 24 עד 48 שעות של התקפים.
עכברים מהונדסים כפולים CX3CR1/GFP ו-NG2DS-Red, שימשו למעקב אחר מיקרוגליה, ו-NG2 לתאים חיוביים ב-Vivo. מבלי לתייג את כלי הדם, microglia, כמו גם טפילים הקשורים כלי, ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים, או OPCs, זוהו. טפילים יש תהליכים מוארכים הבאים לאורך קיר כלי הדם, OPCs בדרך כלל להראות גופי תאים גדולים יותר השוכנים parenchyma המוח, הרחק כלי הדם.
כאשר נעשה שימוש ברודמין B, ניתן היה להבדיל את הפלואורסצנטיות הבהירה יותר של טפילים מהפלואורסצנטיות הקלושה יותר של רודמין זוהר, למרות קריאה דומה במהלך ההדמיה. ההדמיה היומית הראתה כי טפילים היו ממוקמים באופן הדוק, בעוד OPCs ו microglia היו דינמיים. חשוב להקפיד על התבוננות זהירה באזור המדמיין, לצייר מפה מייצגת מדויקת ככל האפשר, ולציין את הצעדים שננקטו כדי להגיע למקומות האחרים ביחס לנקודת ההתחלה.
בהפעלות ההדמיה הבאות, שלבים אלה, המפות שצוירו ביד והתמונות שצולמו בעבר, יהיו קריטיים בזיהוי אותם מיקומים שוב ושוב. טכניקה זו אפשרה לחוקרים להבהיר אינטראקציות נוירון-גליה, אינטראקציות נוירו-חיסוניות, ודינמיקה נוירו-תאית של תקופות זמן ממושכות הן בבריאות והן בפתולוגיה.
