يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام المجهر في Vivo Two-Photon للقيام بالتصور المتكرر للديناميات الخلوية ، في نفس موقع الدماغ على مدى فترات زمنية ممتدة. وميزة هذه التقنية هي أنه من الممكن تصوير التغيرات طويلة الأجل في العناصر الخلوية في الدماغ، بما في ذلك الترتيب، المورفولوجيا، والتفاعلات المادية بين نوع الخلايا المختلفة من الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في استثارة تفاعلات الخلايا وديناميات الخلايا والتغيرات المورفولوجية أثناء لدونة الدماغ والتنكس العصبي.
تبدأ من خلال إعداد الأحداث أو الشباب البالغين, أربعة إلى 10 أسابيع من العمر, فأر غير مغاير CX3CR1 GFP, أن يزن 17 إلى 25 غراما, لزرع نافذة الجمجمة. بعد تخدير الماوس، استخدم أداة حلاقة الشعر لحلاقة الشعر على رأسه، بين الأذنين، تقريبًا، من مستوى العين، إلى أعلى منطقة الرقبة. حرك الماوس إلى محطة الجراحة المجسمة، مخروط الأنف، وتثبيت الرأس باستخدام قضبان الأذن.
الحفاظ على الماوس على وسادة التدفئة، طوال العملية. تليين كلا العينين مع مرهم النفط، ثم حقن 100 ميكرولترات من 0.25٪ بوبوفاكايان، و 100 ميكرولترات من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر dexamethasone، تحت الجلد في موقع شق. انتظر خمس دقائق على الأقل قبل المتابعة.
استنزف الرأس الحليق، مع ثلاث مسحات بالتناوب من البيتادين، و 70٪ الكحول. ثم إجراء شق فروة الرأس منتصف الخط مع شفرة جراحية أو مقص. تمتد من الجزء الخلفي من منطقة الجمجمة، بين الأذنين، إلى منطقة الجبهة بين العينين.
قطع الجلد المتبقية لفضح الجمجمة. استنزف النسيج الضام الموجود بين فروة الرأس والجمجمة الأساسية مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪، وتوطين منطقة الدماغ ليتم تصويرها مع إحداثيات مجسمة. حفر فتحة دائرية، حوالي أربعة ملليمترات في الجمجمة، وذلك باستخدام بت حفر الأسنان.
أثناء الحفر، ترطيب الجمجمة بانتظام مع مسحات معقمة من الملح والقطن لتبريد الدماغ. إزالة قبالة حطام العظام، وتليين عظم الجمجمة. عند الانتهاء، قم بإزالة هذا الجزء من الجمجمة بعناية باستخدام ملقط مدببة.
بعد إزالة الجمجمة، ضع بعناية غطاء زجاجي صغير، مبلل مع المالحة في استئصال القحف. جففي الملح الزائد باستخدام مسح معقمة. باستخدام قضيب مدبب ، ضع الصمغ السيانواكريلات حول النافذة ، والسماح له بالتعلق بالدماغ والجمجمة.
تطبيق الغراء التمهيدي لبقية الجمجمة، وعلاجه مع ضوء علاج لمدة 20 إلى 40 ثانية. إنشاء بئر حول النافذة مع الغراء النهائي، وعلاجه مع ضوء علاج لمدة 20 إلى 40 ثانية. الغراء لوحة رأس صغيرة على الجمجمة، على نصف الكرة الأرضية، والجرق، مع الغراء التمهيدي، ومن ثم مع الغراء النهائي، وعلاج كل لمدة 20 إلى 40 ثانية.
بعد أن يستيقظ الماوس، حقن جرعة واحدة تحت الجلد من البوبرينورفين ريال كما الظلالة بعد العملية الجراحية، والتي سوف تكون كافية لمدة 72 ساعة. إحياء الماوس مع الغذاء الملح اضافية لتسهيل الشفاء الصحي. يمكن إجراء التصوير في وقت مبكر من أسبوعين بعد جراحة الزرع.
استخدم مسامير لتركيب لوحة الرأس على مرحلة المجهر الفوتونتين ، والتي يجب الحفاظ عليها عند 35 درجة مئوية مع لوحة تدفئة. حقن الماوس تحت الجلد مع 100 ميكرولترات من صبغة الأوعية الدموية، مثل رودامين B.Gently تنظيف سطح النافذة القحفية مع مسحة القطن، ودس في 70٪ الإيثانول. ضع بضع قطرات من الماء أو ملحي على النافذة، وخفض العدسة الهدف في الحل.
تأكد من أن الليزر هو إيقاف كما هو خفض الهدف، ورسم خريطة دورة للدلالة على المعالم الرئيسية لالأوعية الدموية، في حين تبحث من خلال العدسة. استخدم هذا الرسم لتعريف مناطق معينة أثناء التصوير بفوتين. جمع صور من الخلايا الفلورية والأوعية باستخدام التصوير الفوتونتين.
انظر مخطوطة النص لمعلمات التصوير، مع تدوين ملاحظات دقيقة مع الإحداثيات المناسبة، لضمان إمكانية إعادة النظر في المناطق الدقيقة للتصوير اللاحق. رسم مثل العديد من مجالات الرؤية في هذه الدورة التصوير الأولي، في نهاية التصوير، واتخاذ الماوس من المسرح، والسماح لها للاستيقاظ من التخدير، وإعادته إلى قفص المنزل. استخدم الملاحظات والصور التي تم الحصول عليها لإعادة تصوير المناطق خلال الجلسات اللاحقة.
تم استخدام هذا البروتوكول لتصور Microglial Dynamics في فيفو، في تايوان YFP-H فئران الخط. dendrites محددة، بمثابة معالم مستقرة لرسم الخرائط الدقيقة لمناطق الدماغ. في حين أن التشعبات هي مستقرة، وبعض microglia التحرك يوميا.
تم استخدام فئران CX3CR1/GFP أحادية المعدلة وراثياً لمتابعة الميكرة الغلية لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع. تم استخدام حقن رودامين B ، لتسمية الأوعية الدموية ، خلال كل جلسة تصوير. في حين أن الأوعية الدموية لا تزال ثابتة بشكل ثابت، وmicroglia هي دينامية.
وقد استخدمت الفئران CX3CR1/GFP، لمتابعة microglia قبل وبعد المضبوطات الشديدة. تم الحفاظ على هيكل السرير الوعائي ، ولكن الشبكة الخلوية الصغيرة ، والمناظر الطبيعية للموضع كانت عابرة. ولوحظت تغيرات أكبر في غضون 24 إلى 48 ساعة من المضبوطات.
مزدوجة المعدلة وراثيا CX3CR1/GFP و NG2DS-الأحمر الفئران، واستخدمت لتتبع microglia، وNG2 إلى الخلايا الإيجابية في فيفو. دون وضع علامة على الأوعية الدموية، تم تحديد المايكروبليا وكذلك الطفيليات المرتبطة بالسفن، وخلايا السلائف oligodendrocyte، أو OPCs. الطفيليات لديها عمليات ممدود التي تتبع على طول جدار الأوعية الدموية، وعادة ما تظهر OPCs أجسام الخلايا الأكبر التي توجد في الدماغ parenchyma، بعيدا عن الأوعية الدموية.
عندما تم استخدام رودامين B ، يمكن تمييز الفلوري الأكثر إشراقًا للطفيليات عن الفلوري الأخاف من الرودامين اللمعان ، على الرغم من الإثارة المماثلة أثناء التصوير. أظهر التصوير اليومي أن الطفيليات كانت متمركزة بشكل ثابت ، في حين كانت OPCs و microglia ديناميكية. ومن المهم أن نرصد المنطقة التي يجري تصورها بعناية، وأن ترسم خريطة تمثيلية دقيقة قدر الإمكان، وأن تشير إلى الخطوات المتخذة للوصول إلى المواقع الأخرى فيما يتعلق بنقطة البداية.
وفي جلسات التصوير اللاحقة، ستكون هذه الخطوات، وخرائط اليد المرسومة، والصور التي التقطت من قبل، حاسمة في تحديد المواقع نفسها مراراً وتكراراً. وقد سمحت هذه التقنية للباحثين لتوضيح التفاعلات العصبية-الدبقية، والتفاعلات العصبية المناعية، وديناميات الخلايا العصبية لفترات زمنية طويلة في كل من الصحة وعلم الأمراض.
