植入颅窗以在清醒小鼠 中重复体内 成像

该协议描述了如何进行病毒注射并植入颅窗，以便在清醒的头部受限小鼠中对脑细胞进行成像。这种方法的优点是神经元和星形胶质细胞的结构和活动可以在多个会话中重复成像。这种方法可用于确定神经发育或神经退行性疾病模型中神经细胞如何改变，或者经验依赖性可塑性是否受损。

首先使用鼻夹和耳杆将麻醉鼠标固定在立体定位框架上。使用无菌手术工具，从前额缝合线到前额缝合线到λ后部切割并去除皮肤。使用无菌尺寸11碳钢手术刀片，轻轻刮下颅骨上的所有结缔组织。

在牙钻的帮助下，沿着同心圆的开口轮廓逐渐钻出颅骨，以促进骨骼的均匀变薄。每次同心刀路后，向钻孔区域添加一滴或两滴盐水，让盐水静置至少10秒钟，然后再继续钻孔。用细镊子轻轻推动颅骨的中心区域，以检查颅骨是否充分变薄并移动。

确保钻孔发生的潜在脉管系统完好无损，并且骨骼未破裂。小心地将微型15度尖刀片插入变薄的骨头中，然后切割并使用浸泡在盐水中的凝胶泡沫来阻止可能发生的任何出血。使用镊子，小心地抬起并取出骨头，注意不要损坏硬脑膜。

对于注射，用20微米的尖端填充无菌斜面玻璃移液器，加入病毒混合物。然后降低移液器以接触大脑表面，并继续降低200至300微米以进行2/3层注射。使用细胞内显微注射分配系统，在两分钟内对系统进行12至15次的压力注射。

对于颅窗植入，将盖玻片放在颅骨的开口处。使用镊子确保玻璃在开口处齐平。要将玻璃窗的边缘密封到头骨上，请在玻璃表面的周围涂上氰基丙烯酸酯粘合剂凝胶。

在粘合凝胶上涂上一层胶水。然后加入一层牙科水泥液体。当牙科水泥硬化时，在直升机型头板的中央开口周围涂上一层薄薄的胶水，并将适当尺寸的直升机型头板放在盖板玻璃上。

让胶水变干。将牙科水泥粉加入1.5毫升微量离心管中，最高可达0.1毫升。将七到八滴快速固化的瞬干胶混合到粉末中，然后将所得混合物吸入一个19号针头的一毫升注射器中，该针头已被切割以形成更大的开口。

将粉末混合物注入直升机杆的侧孔，直到它从两侧渗出。将牙科水泥粘合剂混合物涂在暴露的颅骨的其余部分，将头板固定在颅骨上。用布包裹鼠标，并通过其头板将其固定在空运的家庭笼子的头部固定臂上，然后将家庭笼子暴露在光线下。

习惯化15分钟后，将鼠标从家庭笼子中取出。使用显微镜的宽视场模式，选择两到三个易于识别的脉管系统位置。保存血管的图像，并记录运动控制器上显示的 x 和 y 坐标。

成像神经元的突触结构和星形胶质细胞中的GCaMP6f活性。在代表性分析中，通过对树突和表达GCaMP6f的星形胶质细胞的重复成像在几天内评估颅窗的质量。在一个好的窗口，神经元结构看起来很清脆，有清晰可见的树突状棘。

在成像的第二天出现了两个新的棘。只有一根脊柱持续存在，并且在第五天可见。在不同时间点表达GCaMP6f的星形胶质细胞中研究了钙活性。

在一次运动比赛中目睹了一场包含整个牢房的全球事件。该协议的两个关键步骤是，在移除骨头之前，需要将骨头充分变薄，以及将盖玻片正确放置在开口上。成像可以与行为分析相结合，无论是在成像期间，还是在行为后，例如学习一项新的运动技能，以确定神经元和星形胶质细胞结构和功能如何通过学习进行调节。