Este protocolo demonstra como a microscopia De Dois Fótons in Vivo pode ser usada para fazer visualização repetitiva da dinâmica celular, na mesma localização cerebral por longos períodos de tempo. A vantagem dessa técnica é que, torna possível a imagem das mudanças de longo prazo nos elementos celulares do cérebro, incluindo o arranjo, morfologia e interações físicas entre diferentes tipos celulares do SNC. Essa técnica pode ser especialmente útil na obtenção de interações célula-células, dinâmica celular e alterações morfológicas durante a plasticidade cerebral e neurodegeneração.
Comece preparando um adulto juvenil ou jovem, de quatro a 10 semanas de idade, um rato heterozigoto CX3CR1 GFP, que pesa de 17 a 25 gramas, para uma implantação de janela craniana. Depois de anestesiar o camundongo, use um aparador de cabelo para raspar o cabelo na cabeça, entre as orelhas, aproximadamente, do nível dos olhos, até a região superior da região do pescoço. Mova o rato para a estação de cirurgia estereotática, cone de nariz e estabilize a cabeça usando barras de ouvido.
Mantenha o mouse na almofada de aquecimento, durante todo o procedimento. Lubrifique ambos os olhos com pomada de óleo, depois injete 100 microlitadores de 0,25% bupivacaína, e 100 microlitres de quatro miligramas por mililitro dexametasona, subcutânea no local da incisão. Espere pelo menos cinco minutos antes de prosseguir.
Sangre a cabeça raspada, com três cotonetes alternados de betadina, e 70% de álcool. Em seguida, faça uma incisão de couro cabeludo médio com uma lâmina cirúrgica ou uma tesoura. Estendendo-se da parte de trás da região do crânio, entre as orelhas, até a área frontal entre os olhos.
Corte a pele restante para expor o crânio. Sangre o tecido conjuntivo localizado entre o couro cabeludo e o crânio subjacente com peróxido de hidrogênio de 3%, e localize a área cerebral a ser imagens com coordenadas estereotáticas. Perfurar uma abertura circular, aproximadamente quatro milímetros no crânio, usando uma broca dentária.
Durante a perfuração, umedeceva regularmente o crânio com soro fisiológico e cotonetes de algodão para resfriar o cérebro. Limpe os detritos ósseos e suavize o osso do crânio. Quando terminar, remova cuidadosamente esta parte do crânio com fórceps pontiagudas.
Depois que o crânio for removido, coloque cuidadosamente um pequeno vidro de cobertura, umedecido com soro fisiológico na craniotomia. Seque o excesso de soro fisiológico usando uma limpeza estéril. Usando um aplicador pontiagudo, aplique cola cianoacrilato ao redor da janela, e permita que ele se conecte ao cérebro e ao crânio.
Aplique a cola do primer no resto do crânio, e cure-a com uma luz de cura por 20 a 40 segundos. Crie um poço ao redor da janela com a cola final, e cure-a com uma luz de cura por 20 a 40 segundos. Cole uma pequena placa de cabeça no crânio, no hemisfério contralateral, na craniotomia, com a cola do primer, e depois com a cola final, curando ambos por 20 a 40 segundos.
Depois que o rato acordar, injete uma dose subcutânea de buprenorfina SR como analgesia pós-operatória, que será suficiente por 72 horas. Reviva o rato com alimentos salgados extras para facilitar uma recuperação saudável. A imagem pode ser realizada duas semanas após a cirurgia de implantação.
Use parafusos para montar a placa da cabeça no estágio do microscópio de dois fótons, que deve ser mantido a 35 graus Celsius com uma placa de aquecimento. Injete subcutâneamente o rato com 100 microlitadores de corante de vasos sanguíneos, como Rhodamine B.Limpe suavemente a superfície da janela craniana com um cotonete, com 70% de etanol. Coloque algumas gotas de água ou soro fisiológico na janela, e baixe a lente objetiva na solução.
Certifique-se de que o laser está desligado à medida que o objetivo está diminuindo, e desenhe um mapa de curso para denotar os principais pontos turísticos dos vasos sanguíneos, enquanto olha através da ocular. Use este desenho para identificar as regiões específicas durante a imagem de dois fótons. Colete imagens de células fluorescentes e vasos usando imagens de dois fótons.
Consulte o manuscrito do texto para parâmetros de imagem, tome notas cuidadosas com coordenadas apropriadas, para garantir que as regiões precisas possam ser revisitadas para uma imagem subsequente. Desenhe como vários campos de visão nesta sessão inicial de imagem, No final da imagem, tire o rato do palco, permita que ele acorde da anestesia e devolva-o para sua gaiola doméstica. Use as notas e imagens obtidas para re-imagens das áreas durante as sessões subsequentes.
Este protocolo foi usado para visualizar a Microglial Dynamics In Vivo, em ratos da linha Taiwan YFP-H. Dendritos específicos, serviram como marcos estáveis para o mapeamento fino das regiões cerebrais. Enquanto os dendritos são estáveis, algumas microglias se movem diariamente.
Os camundongos monogênicos CX3CR1/GFP foram usados para seguir microglia por até oito semanas. Injeções de rhodamina B, foram utilizadas para rotular a vasculatura, durante cada sessão de imagem. Enquanto a vasculatura permanece fixa, a microglia é dinâmica.
Os camundongos CX3CR1/GFP foram usados para seguir microglia antes e depois de convulsões graves. A estrutura do leito vascular foi mantida, mas a rede celular microglial, e a paisagem de posição eram transitórias. Maiores alterações foram observadas dentro de 24 a 48 horas de convulsões.
Camundongos CX3CR1/GFP e NG2DS-Red duplos foram usados para rastrear microglia, e NG2 para células positivas In Vivo. Sem rotular a vasculatura, microglia, bem como parasitas associados a vasos, e células precursoras oligodendrocytos, ou OPCs. Os parasitas têm processos alongados que seguem ao longo da parede vascular, e os OPCs normalmente mostram corpos celulares maiores que residem no parenchyma cerebral, longe da vasculatura.
Quando a rhodamina B foi usada, a fluorescência mais brilhante dos parasitas poderia ser distinguida da fluorescência mais fraca da rhodamina luminal, apesar da excitação semelhante durante a imagem. As imagens diárias mostraram que os parasitas estavam posicionados de forma estável, enquanto os OPCs e as microglias eram dinâmicos. É importante fazer uma observação cuidadosa da área que está sendo visualizada, desenhar um mapa representativo o mais preciso possível, e denotar as medidas tomadas para chegar aos demais locais em relação ao ponto de partida.
Em sessões de imagem subsequentes, essas etapas, os mapas desenhados à mão e as imagens tiradas anteriormente, serão cruciais na identificação dos mesmos locais repetidamente. Essa técnica permitiu aos pesquisadores elucidar interações neurônio-glial, interações neuroi imunes e dinâmica neurocelular de longos períodos de tempo em saúde e patologia.
