使用人类脐带血干细胞（CB-SC）治疗后，单核细胞分化成表状独特的巨噬细胞-衍生的外体

干细胞教育者疗法用于治疗 I 型糖尿病和其他自身免疫性疾病。该方法被开发出来，通过CB-SC释放的外体来探索干细胞教育者治疗免疫调节的分子机制。该协议提供了指导，如何从人类脐带血干细胞培养物中纯化外体，并确定它们对单核细胞的免疫调制。

演示这个程序的将是来自我实验室的博士生魏虎。首先，将CB-SC衍生的调节介质像文本手稿中描述的那样三次离心，每次离心后将上流水线收集到一个新的50毫升锥形管中。第三次离心后，使用0.22微升过滤器过滤获得的上清液，将15毫升介质转移到每个10千元离心过滤器单元。

在4000xg的离心机30分钟，以分离浓缩的外显性介质。将浓缩的外显体转移到超离心管。然后在10万xg下对外体进行颗粒，在4摄氏度下80分钟。

然后丢弃上一杯，在10毫升PBS中重新暂停颗粒的外体。执行最后的超离心收集外显颗粒，并在 200 微升 PBS 中重新排泄。将 3000 万个人类 PBMC 添加到 15 毫升管中，以 300 x g 的离心机在 4 摄氏度下 10 分钟。

将细胞重新在300微升的冷PBS中，并加入60微升CD14微珠。混合好，在冰上孵化细胞15分钟。再加入6毫升的冷PBS，在4摄氏度下以300 x g的离心机10分钟。

然后将颗粒细胞重新在500微升的冷运行缓冲液中重新填充。将分离柱放在磁铁分离器中，用两毫升冷运行缓冲液洗涤三次。将重新暂停的单元格转移到分离列中，让它们通过。

同样，每次洗涤用两毫升的运行缓冲液清洗柱三次。然后从磁铁分离器上提起柱，将其放在冰上 15 毫升离心管上。用两毫升冷运行缓冲液将CD14正细胞分离，并在4摄氏度下以300 x g离心10分钟，使细胞产生颗粒。

将颗粒重新放入两毫升冷化学定义的血清介质中，将其 50 微升转移到 1.5 毫升管中。用10微升的Krome橙结合抗人类CD14单克隆抗体染色获得的细胞20分钟。加入一毫升PBS，以300 x g离心10分钟，对细胞进行颗粒化。

将细胞颗粒重新放入200微升PBS中，并转移到5毫升管中。通过流式细胞测定CD14+单细胞的纯度。在经过六井板治疗的组织培养物中，获得100万颗纯化单核细胞，在37摄氏度下孵育2小时，在5%的二氧化碳下。

孵育后丢弃上经剂，轻轻加入两毫升37度预热化学定义的无血清培养基，然后将80微克的CB-SC衍生外显体加入到六井板的单细胞培养物中，总体积为2毫升。在37摄氏度下孵育5%二氧化碳，三至四天。然后使用倒置显微镜以 200 倍的放大倍率对细胞形态进行成像。

添加一毫升基于PBS的细胞分离缓冲液，通过上下移液分离细胞，用细胞刮刀收获剩余的细胞。通过以1，690 x g离心5分钟收集细胞，并在200微升PBS中重新产生细胞。添加五微升的FC阻滞剂以阻止非特异性结合，然后加入抗体。

在室温下孵育细胞30分钟。将一毫升PBS加入孵化细胞，以300 x g离心10分钟。将颗粒重新在 200 微升 PBS 中，每个样品添加 5 微升碘化丙胺。

将细胞转移到新的五毫升流量管中，进行流量细胞学，以评估CD14、CD80、CD86、CD163、CD206和CD209表达的水平。用CB-SC相关标记通过流量细胞学对CB-SC的表型和纯度进行了检查。分析表明，CD45、OCT3/4、SOX2、CD270和galectin9表达水平很高，但未观察到CD34的表达。

流细胞学分析还确认了外显标记、CD9、CD 81和CD63在CB-SC衍生外显体上的表达。外体的大小形态以TEM为特征，大小分布由DLS确定。西方印迹进一步证明了外向关联标记 Alix 的表达， 没有 ER 相关标记的表达式， 卡内辛。

使用荧光显微镜观察到迪奥标记的CB-SC-Exo与PBMC的直接相互作用。为了更好地定义哪些细胞群体与标有CB-SC-Exo的表盘相互作用，不同的细胞室被封闭，并标有细胞特异性标记，如T细胞的CD3、骨髓树突细胞的CD11C、单细胞的CD14、B细胞的CD19和NK细胞的CD56。单核细胞主要针对CB-SC衍生的外体，因为它们表现出高于其他免疫细胞的中位荧光强度。

外显体处理的单核细胞成功地分化成主轴样形态。使用CB-SC衍生的外体治疗后，M2相关标记（如CD163、CD206和CD209）的水平有上升的调节。常规M2巨噬细胞与CB-SC外型诱导M2巨噬细胞之间的表型比较无显著差异。

该协议的关键步骤是将CB-SC衍生的外细胞添加到六井板的培养单细胞中，并孵育三到四天，这需要细胞分化到具有主轴状形态的其他2型巨噬细胞。接下来，我们将探讨CB-SC衍生的外体内部的分子成分，这些分子成分有助于将单细胞分化为2型巨噬细胞。