Kök Hücre Eğitimci tedavisi tip I diyabet ve diğer otoimmün hastalığı tedavi etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem CB-SC salınan ekzozomlar ile Kök Hücre Eğitimci tedavisinin immün ılımlılığının altında yatan molekül mekanizmasını araştırmak için geliştirilmiştir. Bu protokol, insan kordon kanı kök hücre kültürlerinden ekzozomların nasıl arındırılamayacağına ve monositlerin bağışıklık modülasyonunun nasıl belirlenene kadar yol gösterici olacağı konusunda rehberlik sağlar.
Prosedürü gösteren Wei Hu, bir doktora öğrencisi, benim laboratuvardan olacaktır. Başlamak için, CB-SC kaynaklı koşullu ortamı metin el yazmasında açıklandığı gibi üç kez santrifüj edin, her santrifüjden sonra 50 mililitrelik konik tüpün içine süpernatant toplayın. Üçüncü santrifüjden sonra elde edilen süpernatantı 0,22 mikrolitre filtre ile filtreleyin ve her 10 kilodalton santrifüj filtre ünitesine 15 mililitre ortam aktarın.
Konsantre ekzozom ortamı izole etmek için 30 dakika boyunca 4, 000 x g'de santrifüjler. Konsantre ekzozomları ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Sonra 100, 000 x g'da 4 santigrat derecede 80 dakika ekzozomları pelet.
Sonra supernatant atın ve PBS 10 mililitre peletli ekzozomlar resuspend. Ekrompeli toplamak ve 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya almak için son bir ultrasantrifüj gerçekleştirin. 15 mililitrelik bir tüpe 30 milyon insan PBMC ve 300 x g'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj ekleyin.
300 mikrolitre soğuk PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve 60 mikrolitre CD14 mikroboncuk ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve hücreleri 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. 4 santigrat derece 10 dakika boyunca 300 x g soğuk PBS ve santrifüj altı mililitre daha ekleyin.
Sonra soğuk çalışan tampon 500 mikrolitre peletli hücreleri yeniden askıya. Ayırma sütununu mıknatıs ayırıcıya yerleştirin ve iki mililitre soğuk çalışan tamponla üç kez yıkayın. Yeniden askıya alınan hücreleri ayırma sütununa aktarın ve geçmelerine izin verin.
Yine, yıkama başına çalışan tampon iki mililitre ile sütun üç kez yıkayın. Sonra mıknatıs ayırıcı sütun kaldırın ve buz üzerinde 15 mililitrelik santrifüj tüp üzerine yerleştirin. Cd14 pozitif hücreleri iki mililitre soğuk çalışan tampon ile elute ve 300 x g 10 dakika boyunca dört derece santigrat hücreleri pelet.
İki mililitre soğuk kimyasal tanımlı serum ortamındaki peleti yeniden askıya alın ve 50 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Elde edilen hücreleri 10 mikrolitre Krome Orange konjuge anti-insan CD14 monoklonal antikorlarla 20 dakika boyölçün. Hücreleri pelet için 10 dakika boyunca 300 x g pBS ve santrifüj bir mililitre ekleyin.
Hücre peletini 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve beş mililitrelik bir tüpe aktarın. CD14+monositlerin saflığını akış sitometrisi ile belirleyin. Bir doku kültüründe elde edilen saflaştırılmış monositlerin bir milyon tohumu, %5 karbondioksit altında 37 derecede iki saat boyunca altı kuyulu tabak ve kuluçka yada tedavi edildi.
Kuluçka dan sonra supernatant atın ve yavaşça 37 derece önceden ısıtılmış kimyasal tanımlı serum içermeyen kültür ortamı iki mililitre ekleyin, sonra iki mililitre toplam hacmi ile altı-iyi plaka monosit kültürüne CB-SC türetilmiş ekzozomlar 80 mikrogram ekleyin. Plakayı 37 derecede %5 karbondioksit indonuyla 3-4 gün kuluçkaya yatırın. Daha sonra 200X büyütme de ters bir mikroskop kullanarak hücre morfolojisi görüntü.
Yukarı ve aşağı borulama ve bir hücre kazıyıcı ile kalan hücreleri hasat hücreleri ayırmak için PBS tabanlı hücre dissosyasyon tampon bir mililitre ekleyin. Hücreleri 1, 690 x g'de beş dakika santrifüj ederek toplayın ve 200 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Spesifik olmayan bağlamayı engellemek için beş mikrolitre FC bloker ekleyin, ardından antikorları ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka yakan hücrelere bir mililitre PBS ekleyin ve 300 x g'de 10 dakika santrifüj edin. PBS 200 mikrolitre pelet resuspend ve örnek başına propidium iyodür beş mikrolitre ekleyin.
Cd14, CD80, CD86, CD163, CD206 ve CD209 ifade düzeylerini değerlendirmek için hücreleri yeni bir beş mililitre akış tüpüne aktarın ve akış sitometrisi gerçekleştirin. CB-SC'lerin fenotip ve saflığı CB-SC ilişkili belirteçlerle akış sitometrisi ile incelendi. Analizde yüksek düzeyde CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ve galectin 9 ekspresyonu saptandı ancak CD34 ekspresyonu gözlenmedi.
Akış sitometri analizi ayrıca CB-SC kaynaklı ekzozomlarda ekzomemet spesifik belirteçler, CD9, CD 81 ve CD63 ekspresyonunu doğrular. Ekzozomların boy morfolojisi TEM ile karakterize edildi ve boyut dağılımı DLS ile belirlendi. Batı leke daha ER ilişkili marker, calnexin ifadesi olmadan eksnom ilişkili marker Alix ifadesini kanıtlamak.
Diyo etiketli CB-SC-Exo'nun PBMC ile doğrudan etkileşimi floresan mikroskopi ile gözlendi. Cb-SC-Exo etiketli kadranla hangi hücre popülasyonunun etkileştiğini daha iyi tanımlamak için, farklı hücre bölmeleri T hücreleri için CD3, miyeloid dendritik hücreler için CD11C, monositler için CD14, B hücreleri için CD19 ve NK hücreleri için CD56 gibi hücreye özgü belirteçlerle kaplandı. Monositler, diğer bağışıklık hücrelerine göre daha yüksek ortafloresan floresan yoğunlukları sergiledikleri için cb-SC türetilmiş ekzozomlar tarafından hedef alındı.
Ekzozom tedavi monositler iğ benzeri morfolojilere başarılı bir şekilde farklılaşmıştır. CB-SC türetilmiş ekzozomlarla tedavi edildikten sonra CD163, CD206 ve CD209 gibi M2 ilişkili belirteçlerin düzeyinde bir düzenleme vardı. Konvansiyonel M2 makrofajları ile CB-SC eksome indüklenen M2 makrofajları arasındaki fenotipik karşılaştırma anlamlı bir farklılık göstermedi.
Bu protokoldeki en önemli adım, cb-SC kaynaklı ekzozomları altı kuyulu plakalı kültürün monositine eklemek ve üç ila dört gün kuluçkaya yatırmaktır, bu da hücrenin mil benzeri morfolojisi olan diğer tip 2 makrofajlara farklılaşmasına ihtiyaç duyulmasıdır. Daha sonra, tip 2 makrofajlara monosit farklılaşmasının indüksiyonuna katkıda bulunan CB-SC türetilmiş ekzozomların içindeki molekül bileşenlerini inceleyeceğiz.
