줄기 세포 교육자 치료는 타입 I 당뇨병 및 그밖 자기 면역 질병을 취급하기 위하여 개발되었습니다. 이 방법은 CB-SC 방출 엑소좀을 통해 줄기 세포 교육자 치료의 근본적인 면역 적당성 분자 메커니즘을 탐구하기 위하여 개발되었습니다. 이 프로토콜은 인간 코드 혈액 줄기 세포 배양에서 엑소좀을 정화하고 단핵구의 면역 변조를 결정하는 방법에 대한 지침을 제공합니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 웨이 후 (Wei Hu)가 될 것입니다. 먼저, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 CB-SC 유래 조건배지를 3회 원심분리하여 각 원심 분리 후 새로운 50밀리리터 원추형 튜브로 상류관을 수집한다. 세 번째 원심 분리 후, 얻은 상체를 0.22 마이크로리터 필터로 필터링하고 각 10킬로달톤 원심 필터 장치에 15 밀리리터의 미디어를 전송한다.
집중된 외성 매체를 분리하기 위해 30분 동안 4, 000 x g의 원심분리기. 농축 된 엑소좀을 초원심분리기 튜브로 옮기다. 그런 다음 4섭씨에서 80분 동안 100, 000 x g의 외식을 펠렛합니다.
그런 다음 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터에서 펠렛 엑소좀을 다시 중단합니다. 최종 초원심 분리를 수행하여 엑섬 펠릿을 수집하고 PBS의 200 마이크로리터에서 재중단합니다. 3,000만 대의 인간 PBMC를 15밀리리터 튜브에 넣고 원심분리기를 섭씨 4도에서 10분 동안 300xg에 추가합니다.
감기 PBS의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 CD14 마이크로 비드의 60 마이크로 리터를 추가합니다. 잘 섞어서 얼음에 세포를 15분간 배양합니다. 차가운 PBS와 원심분리기 6밀리리터를 섭씨 4도에서 10분간 300xg에 추가합니다.
그런 다음 차가운 실행 버퍼의 500 마이크로 리터에서 펠렛 세포를 다시 중단합니다. 분리 컬럼을 자석 분리기위에 놓고 냉간 실행 버퍼 2밀리리터로 세 번 세척합니다. 다시 중단된 셀을 분리 열로 옮기고 전달합니다.
다시 말하지만, 세척당 두 밀리리터의 러닝 버퍼로 컬럼을 세 번 씻으십시오. 그런 다음 자석 분리기에서 열을 들어 올려 얼음 위에 15 밀리리터 원심 분리 튜브 위에 놓습니다. 감기 실행 버퍼의 두 밀리리터와 원심 분리된 CD14 양성 세포를 Elute 는 세포를 펠릿하는 섭씨 4도에서 10 분 동안 300 x g로 원심분리합니다.
차가운 화학 적 정의 혈청 매체의 두 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 튜브로 50 마이크로 리터를 전송합니다. Krome 오렌지-컨쥬게이드 항인간 CD14 단클론 항체의 10 마이크로리터를 20분 동안 스테인하였다. PBS와 원심분리기 1밀리리터를 300 x g에 넣고 10분간 첨가하여 세포를 펠릿합니다.
PBS의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 유동 세포측정에 의한 CD14+단핵구의 순도를 결정합니다. 조직 배양에서 정제된 단핵구 의 100만 개를 6웰 플레이트로 처리하고 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하였다.
인큐베이션 후 상체를 폐기하고 37도 의 2 밀리리터를 부드럽게 첨가한 다음 CB-SC 유래 엑소좀 80마이크로그램을 6웰 플레이트의 모노사이클 배양에 추가하여 총 2밀리리터를 첨가한다. 3~4일 동안 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 200X 배율에서 반전된 현미경을 사용하여 세포 형태학을 이미지화합니다.
PBS 기반 세포 해리 버퍼 1밀리리터를 추가하여 세포를 위아래로 피펫하여 세포를 분리하고 셀 스크레이퍼로 나머지 셀을 수확합니다. 5 분 동안 1, 690 x g에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 PBS의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. FC 차단제 5마이크로리터를 추가하여 비특이적 결합을 차단한 다음 항체를 추가합니다.
실온에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션된 세포에 PBS 1밀리리터를 넣고 원심분리기를 300 x g에서 10분 동안 추가합니다. PBS의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 샘플 당 프로피듐 요오드의 5 마이크로 리터를 추가합니다.
새로운 5밀리리터 유동 튜브로 세포를 전송하고 CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 및 CD209 발현의 수준을 평가하기 위해 유동 세포측정을 수행한다. CB-SC의 표현형 및 순도는 CB-SC 관련 마커를 사용하여 혈류 세포측정에 의해 검사되었다. 분석은 CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 및 galectin 9 발현의 높은 수준을 보여주었지만 CD34의 발현은 관찰되지 않았다.
유동 세포측정 분석은 또한 CB-SC 유래 엑소좀에 대한 외메 특이적 마커, CD9, CD 81 및 CD63의 발현을 확인한다. 엑소좀의 크기 형태는 TEM을 특징으로하고 크기 분포는 DLS에 의해 결정되었다. 웨스턴 블롯은 ER 관련 마커, 칼넥신의 발현 없이 엑메 관련 마커 알릭스의 발현을 더욱 증명한다.
PBMC와 디오 라벨 CB-SC-엑소의 직접적인 상호 작용은 형광 현미경 검사를 사용하여 관찰되었다. 다이얼 표지된 CB-SC-엑소와 상호 작용하는 세포 집단을 더 잘 정의하기 위해, 다른 세포 구획은 T 세포를 위한 CD3, 골수성 수지상 세포를 위한 CD11C, 단화세포를 위한 CD14, B 세포를 위한 CD19 및 NK 세포를 위한 CD56와 같은 세포 특정 마커로 게이트되었습니다. 단핵구는 그밖 면역 세포의 그보다는 더 높은 중앙위형 광소를 전시하기 때문에 CB-SC 유래 엑소좀에 의해 주로 표적으로 했습니다.
엑소솜 처리 단핵구는 스핀들 모양의 형태로 성공적으로 분화되었다. CB-SC 유래 엑소좀을 치료한 후 CD163, CD206 및 CD209와 같은 M2 관련 마커의 수준에서 강화 조절이 있었다. 종래의 M2 대식세포와 CB-SC 엑소메 유도 M2 대식세포 간의 Phenotypic 비교는 유의한 차이를 보이지 않았다.
이 프로토콜의 핵심 단계는 6웰 플레이트에서 배양단에 CB-SC 유래 엑소좀을 추가하고 3~4일 동안 배양하는 것이며, 이는 스핀들 모양의 형태를 가진 다른 유형 2 대식세포에 세포의 분화에 필요한 것이다. 다음으로, 우리는 타입-2 대식세포로 단핵구의 분화의 유도에 기여한 CB-SC 유래 엑소좀의 안쪽에 분자 분대를 탐구할 것입니다.
