使用紫罗兰兴奋细胞渗透DNA结合染料分离穆林精子生成细胞

这种新的有效方法，隔离亚群的精子细胞和精子从成年小鼠可用于研究微生和精子发生背后的分子机制。此方法使用低细胞毒性DNA结合染料与广泛的激发光谱，可应用于大多数目前使用的FACS订单。此方法非常简单。

最具挑战性的方面是流式细胞仪门控，但详细的门控策略应有助于使协议适应其他细胞分拣机。演示这个程序的将是来自佐藤名川实验室的研究助理叶玉汉。从一只八周大的雄性小鼠中采集两个睾丸后，将组织放在含有两毫升冰冷PBS的60毫米培养皿中，取出图尼卡藻类。

用钳子轻轻分离睾丸，以稍微分散半尼的管。将小管转移到100毫米培养皿中一滴新鲜的冰冷PBS中。使用钳子轻轻解开管状液，并在三个额外的 PBS 液滴中清洗管状液，正如刚才演示的。

最后一次洗涤后，将未解开的半尼弗管放入15毫升的管子中，内含两毫升分离缓冲液，在37摄氏度下孵育20分钟。在孵育结束时，使用1000微升移液器轻轻移液管20次，然后将管子返回孵化器6分钟。在孵化结束时，移液组织再移液20次，然后将管子返回孵化器。

三分钟后，轻轻移液10次，或直到没有可见的组织片段停留，然后停止与10毫升的FACS缓冲液分离。然后，将离心机离心组织悬浮两次，使用额外的10毫升，用于新的FACS缓冲液进行第二次洗涤，以去除精子和尽可能多的碎屑。要染色细胞进行流动细胞测量分析，请将颗粒重新悬浮在三毫升的 FACS 缓冲液中。

并通过70微米尼龙细胞过滤器过滤电池悬浮液，过滤成50毫升的管子。计数后，将10%的细胞转移到冰上的新管中，作为未污染的阴性对照。将六微升的 DCV 污渍彻底混合到剩余的细胞悬浮液中。

在黑暗中37摄氏度下孵育30分钟后，每10分钟轻轻摇晃一次，在细胞中加入5微升DNase I。并通过35微米尼龙网过滤器过滤细胞，放入冰上5毫升的FACS管中。对于细胞的流动细胞测量分析，在流分析软件中创建新实验，在工作表工具菜单下，单击新密度以创建线性比例上的向前散射区与反散射区密度图。

单击新的直方图，在对数刻度上创建 DCV 蓝色直方图图。然后单击"开始"和"记录"开始处理未污染的样本。在样品运行时，单击探测器和阈值设置以调整正向和侧面散射 PMT 电压，将未污染的电池放在前进和背面散点图的刻度上。

调整 jappy 通道的 PMT 电压，以定位 DCV 蓝色直方图对数图第一个十年中 DCV 负位的位置。然后，单击"停止"以卸载未污染的示例。短暂涡旋并加载染色样品后，单击下一管为样品创建新工作表。

将细胞计设置为至少获取六个事件的 10 倍，然后单击"开始"和"记录"。接下来，单击新密度以创建向前散射高度与向前散点宽度。和直流V蓝色与DCV红色密度图在线性比例。

在前进散射区与反散射区域密度图上，使用多边形工具绘制一个名为"单元格"的栅极，以包括大部分单元格并排除小碎片。将此栅极应用于正向散点高度与正向散点宽度图，并使用矩形工具绘制单个单元格的栅极以排除非单个单元格。将单个单元的栅极应用于 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图，并调整刻度以捕获扩展轮廓。

使用多边形工具绘制 DCV 门以排除未污染的单元格和侧总体，并应用该门以线性比例将门应用于 DCV 蓝色直方图图。三个主要峰是指不同的1C、2C和4CDNA含量。在线性比例上创建第二个 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图。

后门DCV门到地块，以找到1C和4C人口。在线性比例上创建另一个 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图。并使用椭圆工具在 1C 总体上绘制门。

使用多边形工具用连续曲线对 4C 总体进行门控。并在线性比例上创建另一个 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图。使用多边形工具创建一个 4C 一个门。

在一个新的向前侧散射图中，使用椭圆工具创建帕奇滕、二氯丁二烯和麻黄素、zygotene精细胞门。绘制所有门后，以线性比例创建新的 DCV 蓝色与 DCV 红色点图，以应用 4C 门，以确保三个填充在门内以连续顺序排列。接下来，在线性比例上创建新的向前散射区与反散射区密度图，并选择细胞的统一大小作为纯圆形精子组。

分类后，分离的钩端素、酶氨酸、帕奇泰尼和二甲苯精细胞分馏的代表性纯度通常介于SYCP3和伽玛H2AX免疫处理确认的80%至90%之间。圆形精子的纯度可以通过与DCV结合SP56和H1t染色的细胞核染色来确认，并且通常也是90%左右，分离细胞群的生存能力通常超过95%，单个成年小鼠中每个分数的平均总产量通常足以进行各种下游分析。排序的细胞可用于各种下一代测序分析，以更好地探索精子生成过程中的基因表达和调控。