성인 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 집단을 격리하기위한이 새로운 효율적인 방법은 meiosis 및 정자 발생의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 현재 사용되는 대부분의 FACS 주문에 적용 할 수있는 넓은 여기 스펙트럼을 가진 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료를 사용합니다. 이 방법은 매우 간단합니다.
가장 어려운 측면은 유동 세포측정 제비이지만 상세한 게이팅 전략은 프로토콜을 다른 세포 선별기에 적응시키는 데 도움이 되어야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 네카와 사토시 연구소의 연구 조교인 유한 예(Yu-Han Yeh)입니다. 8주 된 수컷 마우스에서 두 고환을 수확한 후, 얼음 차가운 PBS 2밀리리터가 들어있는 60mm 페트리 접시에 티슈를 놓고 튜니카 알부기네아를 제거합니다.
고환을 집게로 부드럽게 분리하여 반열구를 약간 분산시합니다. 그리고 100mm 페트리 접시에 신선한 얼음 차가운 PBS 한 방울로 튜블러를 옮춥시다. 집게를 사용하여 튜블을 부드럽게 풀고 방금 입증된 것처럼 PBS의 세 방울로 튜룰을 씻습니다.
마지막 세척 후, 15 밀리리터 튜브에 얽힌 반열성 튜블을 넣고 섭씨 37도에서 20 분 배양을 위해 2 밀리리터의 해리 버퍼를 포함합니다. 인큐베이션이 끝나면 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 튜벌레를 20번 부드럽게 피펫한 후 튜브를 인큐베이터로 6분 더 돌려보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브를 인큐베이터로 되돌리기 전에 조직을 20회 추가로 피펫합니다.
3분 후, 뚜미가 보이지 않는 조직 조각이 남아 있지 않고 FACS 버퍼 10밀리리터로 해리를 멈추기 전에, 튜블러를 10번 또는 뚜피할 때까지 부드럽게 피펫을 한다. 이어서, 조직 현탁액에 원심분리기는 두 번째 세척을 위한 신선한 FACS 완충제에 대해 10밀리리터를 추가로 사용하여 가능한 한 많은 이물질을 제거한다. 흐름 세포 측정 분석을 위해 세포를 염색하려면 FACS 버퍼의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
그리고 70 미크론 나일론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 계산 후, 스테인드 네거티브 컨트롤로 얼음에 새로운 튜브로 세포의 10 %를 전송합니다. 그리고 DCV 얼룩의 6 마이크로리터를 나머지 세포 현탁액에 철저히 혼합합니다.
어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 간 잠복한 후 10분마다 부드러운 흔들림으로 DNase I의 마이크로리터 5개를 세포에 추가합니다. 그리고 35 미크론 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 5 밀리리터 FACS 튜브로 필터링합니다. 셀의 흐름 사이토메트릭 분석을 위해 흐름 분석 소프트웨어에서 새 실험을 만들고 워크시트 도구 메뉴에서 새 밀도를 클릭하여 선형 배율의 백스캐터 영역 밀도 플롯과 비교하여 전방 분산 영역을 만듭니다.
새로운 히스토그램을 클릭하여 로그자리믹 스케일에서 DCV 파란색 히스토그램 플롯을 만듭니다. 시작 및 기록을 클릭하여 스테인이없는 샘플 처리를 시작합니다. 샘플이 실행되는 동안 검출기 및 임계값 설정을 클릭하여 전방 및 측면 분산 PMT 전압을 모두 조정하여 스테인드 셀을 앞뒤로 분산된 플롯의 배율에 배치합니다.
Jappy 채널의 PMT 전압을 조정하여 DCV 블루 히스토그램 로사스믹 플롯의 첫 10년 동안 DCV 음성 모집단의 위치를 찾습니다. 그런 다음 정지를 클릭하여 얼룩진 샘플을 언로드합니다. 스테인드 샘플을 잠시 소용돌이게 하고 적재한 후 다음 튜브를 클릭하여 샘플에 대한 새 워크시트를 만듭니다.
사이토미터를 설정하여 6개의 이벤트에 10회 이상 획득하고 시작 및 기록을 클릭합니다. 다음으로 새 밀도를 클릭하여 앞으로 분산 높이와 전방 분산 폭을 만듭니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 플롯합니다.
전방 분산 영역 대 백스캐터 영역 밀도 플롯에서 다각형 도구를 사용하여 셀이라는 게이트를 그리며 대부분의 세포를 포함하고 작은 이물질을 제외합니다. 이 게이트를 전방 분산 높이대 전방 분산 너비 플롯에 적용하고 사각형 도구를 사용하여 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀이 아닌 단일 셀을 제외합니다. 단일 셀의 게이트를 DCV 블루 대 DCV 적밀도 플롯에 적용하고 스케일을 조정하여 확장 된 프로파일을 캡처합니다.
다각형 도구를 사용하여 DCV 게이트를 그려 스테인드 셀 및 측면 모집단을 배제하고 선형 스케일의 DCV 파란색 히스토그램 플롯에 게이트를 적용합니다. 3개의 주요 봉우리들은 다른 1C, 2C 및 4C DNA 내용을 지칭합니다. 선형 축척에서 두 번째 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 만듭니다.
그리고 다시 게이트 1C및 4C 인구를 찾기 위해 플롯에 DCV 게이트. 선형 축척에서 DCV 빨간색 밀도 플롯과 다른 DCV 파란색을 만듭니다. 그리고 타원 도구를 사용하여 1C 인구에 게이트를 그립니다.
다각형 도구를 사용하여 연속 곡선으로 4C 모집단을 게이트합니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 적색 밀도 플롯과 다른 DCV 블루를 만듭니다. 다각형 도구를 사용하여 4C 하나의 게이트를 만듭니다.
나란히 흩어져 있는 플롯에 의해 새로운 앞으로, 파시텐, 디플롯렌과 렙토텐, zygotene 정자 세포 게이트를 만들기 위해 타원 도구를 사용합니다. 모든 게이트가 그려진 경우 선형 축척으로 새 DCV 파란색 대 DCV 빨간색 도트 플롯을 만들어 4C 게이트에 대한 게이트를 적용하여 세 모집단이 게이트 내에서 연속 순서를 유지할 수 있도록 합니다. 다음으로, 선형 척도에서 백스캐터 영역 밀도 플롯에 비해 새로운 전방 분산 영역을 만들고, 순수한 둥근 정자 집단으로서 세포의 통합 크기를 선택한다.
선별 후, 분리된 렙토텐, zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 분획의 대표적인 순수성은 SYCP3 및 감마 H2AX 면역염색에 의해 확인된 바와 같이 전형적으로 80%에서 90% 사이이다. 둥근 정자 파면의 순도는 Sp56 및 H1t 염색과 함께 DCV와 함께 염색하는 핵에 의해 확인될 수 있으며, 또한 일반적으로 약 90%이며 고립 된 세포 집단의 생존율은 일반적으로 95 %이상이며 단일 성인 마우스로부터각 분수의 평균 총 수율은 일반적으로 다양한 다운스트림 분석에 충분하다. 정렬된 세포는 정자 발생 시 유전자 발현 및 조절을 더 잘 탐구하기 위해 다양한 차세대 염기서열 분석에 사용될 수 있다.
