この新しい効率的な方法は、成人マウスから精子細胞および精子の亜集団を単離するために使用され、明腫および精子形成の根底にある分子メカニズムを調べることができる。この方法は、現在使用されているFACSオーダーのほとんどに適用できる広い励起スペクトルを有する低細胞毒性DNA結合色素を使用する。この方法は非常に簡単です。
最も困難な側面はフローサイトメトリー格子測定ですが、詳細な格子戦略は、プロトコルを他の細胞選別機に適応させるのに役立つはずです。この手順のデモンストレーションは、名川聡研究室の研究助手、ユハン・イェです。生後8週間の雄マウスから両方の精巣を採取した後、2ミリリットルの氷冷PBSを含む60ミリメートルのペトリ皿に組織を入れ、チュニカアルブギネアを取り除きます。
精巣を鉗子でそっと分離し、半細管をわずかに分散させます。そして、100ミリメートルペトリ皿で新鮮な氷冷PBSの滴に尿細管を転送します。鉗子を使用して管状をそっと解き、ちょうど実証したようにPBSの3つの追加の液滴で管を洗います。
最後の洗浄の後、37°Cで20分のインキュベーションのために解離緩衝液の2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに解離されていない半細管を置きます。インキュベーションの最後に、1000マイクロリットルのピペットを使用して細管を20回軽くピペットし、チューブをインキュベーターにさらに6分間戻します。インキュベートの終わりに、チューブをインキュベーターに戻す前に、さらに20回組織をピペットする。
3分後、10ミリリットルのFACSバッファーとの解離を停止する前に、尿細管を10回、または目に見えない組織片が残らないまで静かにピペットします。次いで、2回目の洗浄のために新しいFACSバッファーに対して追加の10ミリリットルを使用して組織懸濁液に遠心分離し、精子およびできるだけ多くの破片を除去する。フローサイトメトリック解析のために細胞を染色するには、ペレットをFACSバッファーの3ミリリットルに再懸濁します。
そして、70ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して、50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液をろ過します。カウント後、細胞の10%を氷上の新しいチューブに移し、染色されていない陰性対照として。そして、DCV染色の6マイクロリットルを残りの細胞懸濁液に十分に混合する。
暗闇の中で摂氏37度で30分のインキュベーションを行い、10分ごとに穏やかな揺れを起わせた後、5マイクロリットルのDNase Iを細胞に加えます。そして、氷の上の5ミリリットルのFACSチューブに35ミクロンのナイロンメッシュストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。セルのフローサイトメトリック解析では、フロー解析ソフトウェアで新しい実験を作成し、ワークシート ツール メニューで新しい密度をクリックして、線形スケールで前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットを作成します。
新しいヒストグラムをクリックして、対数スケール上に DCV ブルーヒストグラム プロットを作成します。そして、開始と記録をクリックして、染色されていないサンプルの処理を開始します。サンプルの実行中に、検出器としきい値の設定をクリックして、前方散乱と側面の両方の散乱PMT電圧を調整して、未染色セルを前方および背面散乱プロットのスケールに配置します。
DCVブルーヒストグラム対数プロットの最初の10年間にDCV負母集団の位置を見つけるには、ジャッピーチャンネルのPMT電圧を調整します。次に、[停止] をクリックして、染色されていないサンプルをアンロードします。染色したサンプルを短時間でボルテックスしてロードした後、次のチューブをクリックして、サンプル用の新しいワークシートを作成します。
6つのイベントに対して少なくとも10回取得するようにサイトメーターを設定し、[開始]と[記録]をクリックします。次に、[新しい密度] をクリックして、前方スキャッタの高さと前方のスキャッタ幅を作成します。そして、線形スケールでDCVブルー対DCV赤色密度プロット。
前方散乱領域と後方散乱領域密度プロットでは、ポリゴンツールを使用してセルと呼ばれるゲートを描画し、ほとんどのセルを含め、小さな破片を除外します。このゲートを前方散乱高さプロットと前方散乱幅プロットに適用し、長方形ツールを使用して単一セルのゲートを描画し、単一セル以外のセルを除外します。単一セルのゲートをDCVブルーとDCVの赤色密度プロットに適用し、拡張プロファイルをキャプチャするようにスケールを調整します。
ポリゴン ツールを使用して DCV ゲートを描画し、染色されていないセルとサイドの母集団を除外し、ゲートを線形スケールで DCV ブルーヒストグラム プロットに適用します。3つの主要なピークは、異なる1C、2Cおよび4C DNA内容物を指す。線形スケールで、第2のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。
そして、1Cと4Cの集団を見つけるためにプロットにDCVゲートをバックゲートします。線形スケールで別のDCVブルーとDCV赤色密度プロットを作成します。楕円ツールを使用して、1C の人口にゲートを描画します。
ポリゴン ツールを使用して、4C の人口を連続曲線でゲートします。そして線形スケールで別のDCVブルー対DCV赤色密度プロットを作成します。ポリゴン ツールを使用して、4C の 1 つのゲートを作成します。
新しい前方散布図では、楕円ツールを使用して、パキテン、ジプロテン、レプトテン、ジゴテン精子細胞のゲートを作成します。すべてのゲートが描画されたら、線形スケールで新しい DCV ブルーと DCV の赤色のカラー ドット プロットを作成し、4C ゲートを適用して、3 つの母集団がゲート内で連続した順序になるようにします。次に、線形スケールで新しい前方散乱面積対後散乱面積密度プロットを作成し、純粋な円形の精子集団として細胞の統一サイズを選択します。
選別後、分離されたレプトテン、ジゴテン、パキテンおよびジプロテン精子細胞画の代表的な純粋度は、典型的には、SYCP3およびΓH2AX免疫染色によって確認されるように80%〜90%の間である。丸い精子の固さを確認するには、Sp56およびH1t染色と組み合わせてDCVによる核染色を行い、また、通常90%程度であり、単離細胞集団の生存率は通常95%を超えており、一つの成体マウスからの各分画の平均総収量は、通常、様々な下流分析に十分である。ソートされた細胞は、精子形成中の遺伝子発現および調節をよりよく探求するために、様々な次世代シーケンシング分析に使用することができる。
