Erişkin farelerden spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını izole etmek için bu yeni etkili yöntem, meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, şu anda kullanılan FACS emirlerine uygulanabilen geniş bir uyarma spektrumlu düşük sitotoksisite DNA bağlayıcı boya kullanır. Bu yöntem çok basittir.
En zorlu yönü akış sitometri gating ama ayrıntılı gating stratejisi diğer hücre ayırıcılar için protokol adapte yardımcı olmalıdır. Prosedürü gösteren Yu-Han Yeh, Satoshi Namekawa Laboratuvarı'ndan bir araştırma asistanı olacaktır. Sekiz haftalık erkek fareden her iki testis hasat sonra, buz soğuk PBS iki mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak dokuları yerleştirin ve tuluk albuginea kaldırın.
Seminiferous tübülleri hafifçe dağıtmak için testisleri forcep'lerle hafifçe ayırın. Ve tübülleri 100 milimetrelik petri kabında bir damla taze buz gibi pbs'ye aktarın. Tübülleri hafifçe çözmek ve tübülleri az önce gösterildiği gibi üç ek PBS damlacıklarında yıkamak için büşraları kullanın.
Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir kuluçka için iki mililitre dissosiasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüp içine untangled seminiferous tübüller yerleştirin. Kuluçka sonunda, tüpü kuvöze altı dakika daha dönmeden önce tübülleri 20 kez hafifçe pipetlemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Kuluçka sonunda, pipet dokular ek 20 kez, tüp kuvöz e dönmeden önce.
Üç dakika sonra, tübülleri 10 kez veya görünür doku parçaları kalmayana kadar hafifçe pipetleyin, 10 mililitre FACS tamponu yla ayrışma yı durdurmadan önce. Sonra, spermatozoa ve mümkün olduğunca çok enkaz kaldırmak için ikinci yıkama için taze FACS tampon için ek bir 10 mililitre kullanarak doku süspansiyon iki kez santrifüj. Akış sitometrik analizi için hücreleri lekelemek için, FACS tampon üç mililitre pelet yeniden askıya.
Ve hücre süspansiyonuna 70 mikron naylon hücresüzden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Saydıktan sonra, lekelenmemiş negatif kontrol olarak hücrelerin %10'u buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Ve kalan hücre süspansiyoniçine iyice DCV leke altı mikrolitre karıştırın.
30 dakikalık bir kuluçka dan sonra 37 santigrat derece karanlıkta nazik sallayarak her 10 dakikada bir, hücrelere DNase I beş mikrolitre ekleyin. Ve hücreleri 35 mikron naylon örgü süzgeçten buz üzerinde beş mililitrelik FACS tüpüne filtreleyin. Hücrelerin akış sitometrik analizi için, akış analizi yazılımında yeni bir deneme oluşturun ve çalışma sayfası araçları menüsü altında, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı ile karşı ileri dağılım alanı oluşturmak için yeni yoğunluğu tıklatın.
Logaritmik ölçekte DCV mavi histogram çizimi oluşturmak için yeni histogramı tıklatın. Ve lekesiz örneği işlemeye başlamak için başlat ve kaydet'i tıklatın. Örnek çalışırken, lekesiz hücreleri ileri ve geri dağılım çizimi ölçeğine yerleştirmek için hem ileri hem de yan dağılım PMT gerilimlerini ayarlamak için dedektör ve eşik ayarlarını tıklatın.
DCV mavi histogram logaritma ilk on yıl içinde DCV negatif popülasyonun konumunu bulmak için jappy kanalı için PMT voltajayarlayın. Ardından, lekelenmemiş örneği boşaltmak için dur'u tıklatın. Lekeli numuneyi kısa bir süre girdaplayıp yükledikten sonra, örnek için yeni bir çalışma sayfası oluşturmak için sonraki tüpü tıklatın.
Sitometreyi altı etkinliğe en az bir kez 10 almak için ayarlayın ve başlat ve kaydet'i tıklatın. Ardından, ileri dağılım yüksekliği ve ileri dağılım genişliği oluşturmak için yeni yoğunluk seçeneğini tıklatın. Ve DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk çizer doğrusal bir ölçekte.
İleri dağılım alanı ve geri dağılım alanı yoğunluğu çiziminde, hücrelerin çoğunu içerecek şekilde hücre adı verilen bir kapı çizmek ve küçük enkazı dışlamak için çokgen aracını kullanın. Bu geçidi ileri dağılım yüksekliğine karşı ileri dağılım genişliği çizimine uygulayın ve tek hücreolmayan hücreleri hariç tutmak için tek bir hücrenin kapısını çizmek için dikdörtgen aracını kullanın. Tek hücrenin kapısını DCV mavisine karşı DCV kırmızı yoğunluk çizimine uygulayın ve genişletilmiş bir profili yakalamak için ölçeği ayarlayın.
Lekelenmemiş hücreleri ve yan popülasyonu dışlamak için bir DCV kapısı çizmek ve doğrusal ölçekte Bir DCV mavi histogram çizimine geçit uygulamak için çokgen aracını kullanın. Üç ana zirvefarklı 1C, 2C ve 4C DNA içeriğine atıfta bulunur. Doğrusal ölçekte ikinci bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun.
Ve 1C ve 4C popülasyonlarını bulmak için plan üzerine DCV kapısı arka kapı. Doğrusal ölçekte başka bir DCV mavisi ile DCV kırmızı yoğunluk çizimi oluşturun. Ve 1C popülasyonuna bir kapı çizmek için elips aracını kullanın.
4C popülasyonuna sürekli bir eğri yle geçit vermek için çokgen aracını kullanın. Ve doğrusal bir ölçekte başka bir DCV mavi karşı DCV kırmızı yoğunluk arsa oluşturun. 4C tek kapı oluşturmak için çokgen aracını kullanın.
Yan dağılım arsa yeni bir ileri, pachytene, diploten ve leptoten, zigot spermatosit kapıları oluşturmak için elips aracı kullanın. Tüm kapılar çizildiğinde, üç popülasyonun kapı içinde sürekli sırada olduğundan emin olmak için 4C kapısı için uygulamak için doğrusal ölçekte yeni bir DCV mavisi ile DCV kırmızı renkli nokta çizimi oluşturun. Ardından, doğrusal ölçekte geri dağılım alanı yoğunluğuna karşı yeni bir ileri dağılım alanı oluşturun ve saf yuvarlak spermatid popülasyonu olarak hücrelerin birleşik boyutunu seçin.
Sıralamadan sonra, ayrılmış leptoten, zigotene, pachyten e-pişen ve diploten spermatosit fraksiyonlarının temsili saflıkları genellikle SYCP3 ve Gamma H2AX immünboyama tarafından doğrulanan %80 ile %90 arasındadır. Yuvarlak spermatid hizip saflığı Sp56 ve H1t boyama ile birlikte DCV ile çekirdek boyama ile teyit edilebilir, ve aynı zamanda tipik olarak yaklaşık 90%Izole hücre popülasyonlarının canlılığı genellikle% 95 üzerinde ve tek bir yetişkin fare her fraksiyonun ortalama toplam verimleri genellikle çeşitli downstream analizi için yeterlidir. Sitolunan hücreler spermatogenez sırasında gen ekspresyonunu ve regülasyonlarını daha iyi keşfetmek için çeşitli yeni nesil sıralama analizleri için kullanılabilir.
