小鼠大脑的自由漂浮免疫染色

小鼠大脑的免疫组织化学染色是神经科学研究中常用的技术。然而，脑组织学结果的质量，可靠性和可重复性可能因不同的研究人员和实验室而异。我们提出了一种既定的小鼠大脑组织学研究方法，该方法已被证明是可重复的，可靠的和有效的。

帮助我演示该程序的将是来自我实验室的助理教授Chunmei Wang博士 在确认在8至16周龄的C57黑色/ 6J小鼠中成功麻醉后，将鼠标固定在泡沫板上，并沿着胸部和腹部的中线做一个纵向浅表切口，然后将皮肤移到一边以暴露胸部和腹部的肌肉壁。接下来，在肌肉层做一个切口，露出肝脏和肠道。然后，用剪刀切开胸腔，露出心脏和肺部。

使用止血钳将胸腔拉到一边以扩大工作区域。下一个。放置灌注套管，用钝套管直接穿透左心室，小心地将其插入升主动脉。在泡沫板上的套管和耦合管的连接处放置销钉，以在灌注过程中将套管固定到位，然后继续切割右心房以允许血液从循环中流出。

对于盐水灌注，打开盐水压力开关，用40至60毫升盐水经心电图灌注小鼠。密切观察右心房的流出和肝脏的颜色。接下来，要用福尔马林灌注，请关闭盐水压力开关并打开福尔马林压力开关，用40毫升10%中性缓冲福尔马林给小鼠灌注。

观察动物的四肢是否有震颤的证据。对于脑部隔离，使用剪刀去除头部，沿着外皮做一个中间线切口以暴露颅骨，然后修剪掉皮肤和肌肉附件。接下来，在眶脊处做一个切口，并将虹膜剪刀的尖锐端放入大孔中。

沿着颅骨内表面推进剪刀，保持向上的压力以避免对大脑的损害。然后，小心地切除顶骨和额骨和脑膜，然后再从开放的颅骨中取出大脑。将干冰放在滑动切片机的高度调节板上，等待可见白色霜冻，然后在蔗糖冷冻后小心地将五毫升30%蔗糖撒在板顶部，形成坚实的基础层。

接下来，将所有脑样本水平放置在蔗糖基底顶部的一条线上，其中含有500微升30%蔗糖。冷冻5到10分钟后，当大脑变得坚硬和白色时，修剪大脑直到达到所需的层或区域，然后，从修剪模式切换到进食模式并切片脑组织以产生25微米厚的切片。接下来，准备一个装满PBS的48孔板，并为一个小鼠大脑标记五个孔。

使用画笔，收集一个部分并将其放入一个孔中，然后收集同一鼠标的后续部分并将其放入第二个孔中。重复该过程，直到达到第五个井，在第一到第五个孔中放置第6至10部分，依此类推。将细胞过滤器放入充满PBS的六孔细胞培养板的一个孔中，并使用画笔将一系列脑切片转移到细胞过滤器中。

通过将细胞过滤器转移到摇床上装满PBS的另一个孔中，在PBS中冲洗这些部分。然后，将细胞过滤器中的大脑切片转移到含有一毫升生物素标记的WFA的1.5毫升管中，并以50 RPM在摇摆平台上孵育过夜。第二天，如前所述，用PBS冲洗大脑切片，然后将切片转移到含有一毫升链霉亲和素日光488溶液的管中，并在摇摆平台上孵育两个小时。

再次用PBS冲洗脑部后，将它们在封闭缓冲液中孵育两个小时，然后在摇动平台上在一抗中孵育过夜。第二天，在PBS冲洗后，将切片在二抗中孵育两个小时。用100毫升PBS填充两个培养皿，并将所有大脑部分从一个过滤器转移到第一个盘子中。

按神经解剖学顺序排列大脑部分，从尾部到喙部。然后，将一个滑块浸入第二个培养皿中，一端用支架略微倾斜，并使用精细的画笔，轻轻地将空气缓冲接口正下方的大脑部分放在倾斜的滑块上。接下来，使用转移移液器，缓慢而轻柔地取出缓冲液以降低其水平，直到大脑部分完全位于空气缓冲器接口上方。

继续重复此过程，直到到达幻灯片的底部，并且所有部分都安装到幻灯片上。要进行成像，请打开扫描仪和计算机，然后将载玻片与装载装置一起放置在载玻片支架中，并将支架插入扫描仪。打开扫描仪的软件，然后选择适当的存储位置和扫描配置文件。

通过单击开始预览扫描按钮开始预览扫描。扫描完成后，打开组织检测向导，并圈出感兴趣的区域以进行成像。选择要映像的区域后，单击"开始扫描"按钮并等待计算机完成扫描。

检查结果文件并导出图像。这里显示的是Bregma阴性0.82毫米处的冠状小鼠脑切片的代表性荧光免疫组织化学图像，显示了紫藤凝集素，精氨酸血管加压素和DAPI的分布。在下丘脑前部和网状核的周区域观察到紫藤凝集素信号，而在室旁核中观察到精氨酸血管加压素信号。

首次尝试此协议时，我们建议在经验丰富的研究人员的监督下执行。该协议将有助于在不同的研究人员和实验室中产生最佳和一致的组织学结果，并将作为初学者学习该技术的参考。