研究肿瘤分泌性副体结扎对宏噬细胞活化的影响，使用可渗透膜支架共培养

这种Transwell共培养方法用于研究肿瘤细胞用于抑制免疫反应的寄生虫信号。这种方法可用于发现新的分泌配体，以及其免疫抑制作用的机械基础。我们以前曾使用这种方法来显示肿瘤分泌因子如何抑制巨噬细胞亲炎基因转录。

我们相信，这个工具在肿瘤衍生免疫抑制的研究中具有广泛的意义。该技术的主要优点之一是，它可用于研究肿瘤细胞和免疫细胞之间的寄生虫信号，而不用细胞间接触的潜在混淆变量。该平台还适用于各种分子生物学技术，用于下游分析。

收获后，将内酮巨噬细胞直接板入0.4微米聚酯膜的上腔内插入共培养六井板。然后添加补充的DMEM到井，使顶部室包含一毫升和底部室包含1.5毫升。在37摄氏度下孵育三天，二氧化碳含量为5%。

首先，按照 ATCC 推荐的组织培养方法，在各自的培养中培养可商用的肿瘤细胞。接下来，用PBS清洗粘附肿瘤细胞一次。在EDTA中加入0.05%的三辛，在37摄氏度下孵育，直到细胞分离。

然后重新挂起包含 FBS 的介质中的单元格。使用血细胞计或细胞计数器定量细胞总数和离心机在220倍G五分钟颗粒。在离心过程中，从含有渗透膜支撑板的巨噬细胞的上腔和下腔中吸出介质，代之以新鲜介质。

对于将镀膜的下腔室，用一毫升的介质而不是1.5毫升填充，以留下足够的体积来补充细胞。离心完成后，从颗粒肿瘤细胞中吸出介质，以每毫升30万个细胞的浓度重新悬浮补充DMEM中的细胞。将此细胞悬浮液的0.5毫升添加到所需油井的下腔中。

为了诱导巨噬细胞亲炎基因表达，通过添加干扰素伽马，浓度为每毫升100毫微克，以每毫升50毫微克的浓度单独治疗或共同培养的巨噬细胞。根据需要改变培养中的治疗时间。巨噬细胞活化发生在两个小时内，一些肿瘤中位抑制发生八小时。

24 小时共培养产生稳健且一致的肿瘤源抑制。作为一种负对照，培养巨噬细胞单独离开未经处理。作为一种阳性对照，用干扰素伽马和LPS以与样品相同的浓度单独培养的巨噬细胞进行治疗。

在所需的孵育时间过后，根据测试需要，根据需要分离细胞分离或条件培养培养。为了分离细胞酸盐进行定量聚合酶链反应分析，从井的两个腔室中吸出介质，用两毫升PBS洗涤一次。将RNA解液缓冲液涂抹在含有巨噬细胞的顶室。

之后，轻轻刮擦膜以释放细胞酸盐，然后根据RNA隔离试剂盒制造商的协议将其转移到收集管中进行进一步处理。此处描述的共培养方法涉及巨噬细胞和肿瘤细胞的培养，没有物理接触。在没有肿瘤细胞的情况下培养的性腺巨噬细胞被用作阴性与阳性对等对等。

在B16F10肿瘤细胞的存在下共培养的佩罗酮性巨噬细胞，但没有激活刺激，不会增加亲炎相关基因的表达。这意味着肿瘤分泌配体要么不足以诱导亲炎基因表达本身，或者如果有免疫激活的肿瘤分泌物，准理体配体足以抑制它到其原生水平。这种共培养方法表明，当由干扰素伽马和LPS两极分化的巨噬细胞在肿瘤细胞存在的情况下培养时，当巨噬细胞系J774被围死巨噬细胞取代时，炎症相关基因表达的抑制减少了60%A可比水平的巨噬细胞蛋白炎基因抑制。

先前的研究已经确定蛋白质S是一种肿瘤分泌因子，可以抑制巨噬细胞的活化，因此渗透膜支持共培养模型与lysA结合使用，在24小时后测定条件介质中蛋白质S的浓度。在来自干扰素伽马和LPS处理B16F10黑色素瘤细胞的有条件介质中，蛋白质S以每毫升约475毫微克的浓度表达。在相同条件下治疗的佩里托内巨噬细胞表示蛋白质S，每毫升约61毫微克。

有趣的是，当共同培养时，干扰素伽马和LPS处理良好的蛋白质S的浓度约为每毫升86毫微克。这表明，当存在巨噬细胞时，巨噬细胞摄入肿瘤分泌蛋白质S或B16F10细胞分泌的蛋白质S的含量会大大减少。这些结果突出了巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养时巨噬细胞活化和抛物线信号的深刻变化。

Transwell 共培养方法可以回答与参数信号相关的各种问题。可以进行西方的印迹分析，以确定肿瘤分泌的蛋白质如何改变巨噬细胞中的各种信号通路。