在健康和受伤的老鼠心脏中为三维纤维细胞组织进行精炼的清晰组织清除

这种新型组织清除协议改进了现有技术，使体内对心脏特定细胞类型及其在损伤条件下的行为有更准确的观察。此协议是快速和相当简单的。它允许维持马卡荧光与最小的干扰，从背景组织自动荧光，而无需细胞或组织染色。

首先使用70%乙醇浸泡纱布垫清洁实验鼠的腹腔表面。使用手术剪刀做一个三厘米的横切口，大约三米以下的xiphoid过程和脱光小鼠从腹部到西菲德过程，以分离皮肤从底层腹部壁组织。在皮下腹部壁组织中切口两厘米，在 xiphoid 过程下方三厘米处切口，并通过肋骨笼从中线垂直切开。

把肋骨笼钉回去露出心脏。并使用配备 27 号针头的 10 毫升注射器将冷 PBS 注射到高级静脉卡瓦和主动脉中。当所有的血液都从心脏冲洗，送10毫升的冷4%PFA到优越的静脉卡瓦和主动脉开始固定过程。

当所有的固定剂都闪过，切除心脏，并使用直刀手术刀分离腹腔，右心室和隔膜和左心室。将心脏放入一个15毫升的冷4%PFA圆锥管中，在坚果上以4摄氏度进行夜间孵化。第二天早上，在刚准备好的水凝胶溶液中加入0.25%的光照启动器溶液，并将心脏转移到水凝胶中。

将圆锥管包裹在铝箔中，在四摄氏度下进行夜间孵化，不会受到身体干扰。第二天早上，在37摄氏度的珠子浴中加热管子2.5小时，然后用钳子将心脏小心地转移到15毫升的PBS管中。在 PBS 中洗心脏三次，每次洗一小时，在 37 摄氏度的螺母上，并将心脏转移到有源电泳机的篮子中。

将盖子固定到位，用电泳清除液填充活性电泳室储液。腔室完成后，将篮子浸入溶液中，并将电泳机的盖子拧紧到位。然后在 1.5 安培和 37 摄氏度下运行电泳机 1.5 小时。

电泳后，在视觉上检查心脏，以确保没有不透明的组织残留。在15毫升的两个中洗清心三次，在新鲜的PBS中洗一个小时，每次洗37摄氏度。在将心脏浸入去色剂中以减少下黄体自动荧光之前。

48 小时后，在 PBS 中洗涤心脏三次，以示效果，并在成像前 48 小时在新准备的 RIMS 中平衡心脏。对于已清除心脏的 3D 成像，首先，将一层薄薄的真空润滑脂放在 3D 打印底部储液层的底部，与正在成像的样品高度相同。将储液池装满RIMS，并使用移液器尖端去除任何气泡。

小心地将心脏放在 RIMS 中，左心室壁朝上，注意解决方案中不会引入气泡。使用真空润滑脂将玻璃盖滑贴到 3D 打印的顶部储层片的底部表面，并将顶部储层盖滑落到底部储层上，注意避免气泡。然后用甘油填充顶部储层。

使用协聚焦显微镜对被清除的心脏进行成像。将精密的心脏组织清除与 3D 成像相结合，可对心脏成纤维细胞进行高级详细可视化。使用这种成像技术，成纤维细胞被观察到密集包装，并在未受伤的心脏有一个旋转形态。

缺血性输液损伤后，在缺血区发现心脏成纤维细胞在受伤后的头三天出现损失。到第7天和第14天，成纤维细胞已经迁移或增殖，以重新填充受伤的组织区域。到第28天，心脏受伤区域周围心脏成纤维细胞的密度最大。

心肌梗塞受伤一天半后，受伤的左心室内几乎没有成纤维细胞。然而，到第三天，成纤维细胞扩大，并存在于大多数左心室。与缺血手术相比，在几周内输注二号血管紧张素和苯甲苯丙蛋白不会导致心脏组织损失和壁变薄。

相反，成纤维细胞沿着右手螺旋收缩模式的轴线对齐，如使用精制组织清除协议时所见。此外，经过血管紧张素二和苯甲酸酯治疗后，成纤维细胞显得小而圆润，而不是在缺血性复发和心肌梗塞损伤模型中观察到的主轴形状。电泳清除需要小心执行，尤其是在与已接受伤害协议的心脏一起工作时。

此协议可用于评估心脏成纤维细胞对体内损伤的反应。不同的荧光标记也可用于了解心脏在细胞水平上对损伤的反应。