该协议使我们能够以显著的纯度分离静态和损伤引起的活化成纤维细胞种群。这种技术的主要优点是它的灵活性即兴。对于流，以及基于珠子的分离，可以结合抗体对污染细胞，以排除他们从分离的目标细胞。
此技术主要用于心脏成纤维细胞分离。然而，它可用于从其他组织分离成纤维细胞。演示这个程序的将是米玲梅尔泽，一个本科实习生和大卫比尔，一个研究助理，从我的实验室。
要准备一个六井板，用于在解剖期间储存六颗心，将两毫升冷KHB放入每个井中，然后将板放在冰上。用70%乙醇喷洒身体。定向它，使腹侧面对实验者。
固定附属物以防止干扰。在不刺穿肝脏的情况下，切开腹部皮肤和肌肉。垂直切向胸骨，小心地打开胸骨，而不会刺穿心脏。
接下来，继续切开肋骨，露出心脏。使用钳子，轻轻地将心脏从胸部中抬起，切开任何附着在心脏外部的肺或多余的组织。分离左心室。
对于每次解剖，将心室放在六孔板的单独井中。首先，使用钳子反复挤压和搅拌KHB中心室，以去除多余的血液。将心室转移到一个清洁、无菌的 10 厘米方形板中。
接下来，使用单刃刀片，快速将心室切碎成小块。加入一毫升胶原酶消化鸡尾酒，继续切碎。当碎片足够小，可以用一毫升微移子转移时，将它们转移到50毫升的圆锥管中。
用两毫升鸡尾酒洗盘子两次，然后将洗涤转移到管子上。孵育管30分钟，然后使用五毫升移液器重新暂停手稿中描述的细胞。初始再增后，孵育细胞15分钟，然后使用10毫升移液器再次重新暂停。
然后，将一个 40 微米细胞过滤器放在新的 50 毫升锥形管上，然后用 1 到 2 毫升 KHB 润湿，使应变器保持素。在消化悬浮液中加入25毫升KHB，然后重新悬浮。通过过滤器过滤悬浮液，根据需要更换过滤器。
在400倍g和4摄氏度下离心10分钟。取出上流液，使用每颗心脏5毫升缓冲液将颗粒重新在1x RBC解液缓冲液中。在室温下将悬浮液孵育两分钟后，在室温下以 400 次 g 离心悬浮液，在室温下将悬浮液离心机 10 分钟。
取出上一液，然后将颗粒重新在一毫升KHB中。然后，在悬浮液中加入九毫升 KHB。通过 40 微米的底片电池滤株将悬浮液过滤到新的 50 毫升锥形管中。
在室温下以 400 倍 g 离心锥形管 10 分钟。最后，去除上一除骨剂，将颗粒重新在一毫升成纤维细胞介质或PBS中。确定细胞号后，可以通过手稿中描述的三种不同方法从悬浮液中分离成纤维细胞。
要开始通过差分电分离，通过在每个井中加入两毫升的成纤维细胞介质来准备一个六井板。旋转板以覆盖井底。如果小鼠心脏细胞悬浮在PBS中，则将离心机重新悬浮在每颗心脏一毫升的成纤维细胞介质中。
在每个井中加入一毫升的细胞悬浮液，相当于一颗心脏。旋转板以均匀分布细胞。每井添加一到两毫升的成纤维细胞介质，总体积高达每井四毫升。
在37摄氏度下孵育4小时。由于成纤维细胞将选择性地粘附在油井上，因此可以通过移除和丢弃介质来隔离它们。用两毫升PBS清洗剩余的附着细胞，然后每井加入2至4毫升无菌成纤维细胞介质。
在37度孵育，直到汇合，每两到四天更换一次介质。为了开始对CD45阳性造血细胞进行磁性标记和分离，将小鼠心脏细胞的悬浮液以500倍g离心5分钟。取出上流液，将细胞颗粒重新在一毫升的平衡缓冲液中。
使用血细胞计计算细胞。再次离心细胞后，在平衡缓冲液中重新填充细胞颗粒。加入CD45正磁珠，混合好。
在4摄氏度下孵育至少15分钟。通过添加平衡缓冲液和在 4 摄氏度下以 500 倍 g 离心 10 分钟来清洗细胞。取出上清液，并使用血细胞计计算细胞。
将颗粒重新在平衡缓冲液中。通过 40 微米过滤器进行悬浮液，以防止细胞聚合堵塞分离柱。接下来，在合适的分离器的磁场中放置分离柱，并平衡该柱与至少三毫升的 PBS。
将悬浮液倒入柱中，并在 15 毫升锥形管中收集流经，该流经将包含未标记的细胞。用三毫升平衡缓冲液清洗柱，并将洗涤与流式处理相结合。从分离器上拆下柱，将柱放在 15 毫升圆锥形管上。
要将标有 CD45 阳性的细胞进行回流，移液器将五毫升的平衡缓冲液插入柱中，然后将柱牢牢地插入。将水闸管和流管以 500 倍 g 离心。使用血细胞计计算细胞。
要完成分离，请遵循CD31阳性内皮细胞和 MEFSK4 阳性成纤维细胞的手稿中的规程，这些协议与 CD45 阳性细胞的协议类似。在心肌梗死后从α-SMA-GFP小鼠心脏分离出的单细胞上进行荧光激活细胞分选。代表性的浇注方案演示 GFP 阳性细胞共同表达 CD31、CD45 或 AN2。
在受伤的小鼠心脏中，一小部分内皮细胞和造血细胞表达GP。然而，GFP阳性/CD31-阴性/CD45-阴性细胞没有表达N2，一个周字节标记。GFP阳性细胞表示α-SMA，胶原蛋白一阿尔法一，周一汀和维门汀。
未受伤的成纤维细胞通过选择性粘附分离表达维门汀，但未表现出α-SMA、周利汀或胶原蛋白的表达。未受伤和激活的成纤维细胞均表示 MEFSK4 抗原。两种未受伤的成纤维细胞，通过选择性粘附分离，和肌纤维细胞，从α-SMA-GFP小鼠分离和排序，证明有能力收缩胶原蛋白。
在孵化前彻底切碎组织是重要的。在基于珠子的分离之前，通过 40 微米过滤器进行悬浮液以防止细胞聚集非常重要。使用这种方法净化的细胞可以使用与紫水晶特异性抗体相关的磁珠进一步纯化，以确保高水平的纯度。
随着新的珠结合抗体的提供，以及记者转基因小鼠，人们可以利用这些技术来分离和研究不同的细胞群，而不仅仅是成纤维细胞。
