你好，我叫巴托洛梅奥·博斯科，我是意大利特伦托大学综合生物学中心转录网络实验室的博士生。如您了解，转录是一个极其复杂的过程，涉及转录因子和辅助因子的空间和时间组织。他们中的大多数，包括人类P53，识别特定的 cis-作用元素，称为反应元素，并结合这种DNA测序需要调节目标基因的转录。
在这项工作中，我们想向您展示使用酵母作为模型系统作为蛋白质在彩色报告基因或荧光酶或细胞生长的定量研究P53序列特异性方案，以突出主要的实验步骤和这些方法的多功能性。协议一，构建含有腺苷-2上游特定P53反应元素或萤火虫荧光酶基因的记者酵母菌株。要构建记者菌株，首先按照步骤1.1到1.15将酵母细胞与寡核苷酸对准所需启动子区域进行转化。
该转换基于基于标准醋酸锂的协议。一旦转化剂出现在5-FOA板上，通常在30度孵育三天后，将它们复制到非选择性YPDA板和含有G418的YPDA板上，标记每个板，以方便其后续比较。在30度下孵育板。
第二天，从G418敏感，但在YPDA板块生长的殖民地确定候选记者菌株。在一个新的YPDA板块上分离识别的菌落，以获得单一菌落的分离物，并让他们在30度下生长两天。检查所需 P53 响应元件的正确集成，执行符合步骤 1.20 中所述条件的 PCR 反应。
在糖糖凝胶上装载PCR产品的等分，在桑格测序之前检查正确的安培长度。协议二，提出了一个如何使用定性的基于颜色的腺氨酸-2酵母测定评估P53蛋白转活能力的例子。按照第一节中描述的相同醋酸锂协议，使用P53表达载体转换酵母细胞。
条纹单酵母转化菌落，高达6个每板，在一个新的选择性板，并让他们在30度过夜生长。第二天，使用无菌天鹅绒，复制板上新的选择性板的条纹，允许评估颜色表型，即选择性板含有限制腺氨酸的数量。
在30度孵育三天。相同的条纹可以多次复制镀。方案三，现举例说明利用定量发光LUC1酵母测定法评价P53蛋白转活能力。
首先，利用P53表达载体转换酵母细胞，第二节中描述的乙酸锂协议再次发生。将含有葡萄糖作为碳源的新选择性板上修补单一转化剂，并让他们在一夜之间以30度生长。对于每种转换类型，制作五到七个不同的修补程序。
隔夜生长后，使用无菌牙签或移液器尖端在含有拉芬糖的合成选择性介质中重新吸收少量细胞作为碳源。这些细胞悬浮液的光学密度应在 0.4 左右的 600 纳米，然后可拆分成多个 96 孔板，在不同温度下进行孵化，或使细胞暴露在不同数量的半乳胶中，以激活 P53 表达。为了测量萤火虫记者的活动，将10至20微升的细胞悬浮液从透明96井板转移到白色384井板中，并在摇床上用等量的解液缓冲液混合细胞，在室温下孵育10、15分钟。
加入10，20微升萤火虫荧光素酶基板。并使用多标签板读卡器测量光单位。还测量 96 井板中培养物的光学密度。
协议四，我们现在提出了一个如何利用P53诱导的酵母生长抑制的例子。使用 P53 表达向量转换酵母细胞，或使用表达式向量进行共译，以共同表达 P53 及其辅助因子之一（如 MDM2），然后再次使用第一节中描述的基于醋酸锂的协议。在选择性介质中将转化细胞增长到大约一个光学密度。
稀释至0.05，并在适当的浓度中加入选定的分子。在摇床上孵育细胞30度42小时。然后，在最小的选择性培养中播种100微升酵母细胞培养。
在30度下孵育两天。正确的 RE 集成代替 ICORE 盒式磁带可以由菌落 PCR 检查，从候选酵母克隆的少量细胞开始，并使用表三中描述的底像来放大目标位点。PCR产品，一个带约500核苷酸，然后可以通过桑格测序检查，以确认编辑的基因组位置序列是否存在正确的P53响应元素序列。
记者应变准备用于功能测定。要评估P53蛋白转活能力，检查酵母菌落的颜色。例如，我们使用两个不同的记者 P21-5-prime 和 PUMA 以及两个不同的温度 30 度和 37 度来比较野生型 P53 和突变体 R175H 和 R282W。
有趣的是，虽然R175H是一种功能丧失的P53等位基因，在所有条件下都是红色菌落，R282W显示温度敏感性，残余转活活性在30度，导致白色菌落，但在37度时失去活性，导致红色或粉红色菌落。图二中提供了一个扩展数据集，在四个突变等位基因中，有四个突变等位基因的 B.Wild 型 P53 测试了转活，使用 10 种不同的 P53 响应元素报告器菌株、三个温度和组成表达水平。结果总结在颜色代码，提醒酵母菌群颜色表型。
P53 K139E突变等位基因保持部分活性，对寒冷敏感。例如，GADD45 记者应变为 24 度和 30 度时为红色，但在 37 度时为白色。在这里，我们提出了一个用这种方法获得的结果的例子，比较了人类和C.elegans P53酵母的转活特异性。
条形图中的结果表示为平均相对光单位，标准误差为四个复制。比较了五个不同的P53响应元素。通过改变介质中乳糖的浓度，测试了三种不同水平的P53蛋白表达。
两个P53正交体表现出明显不同的转活特异性。与 ced13 和 V1 响应元素共享相同序列的结果就是例证，但存在或不存在 28 核苷酸空间器除外。人类P53表现出更高的转换与V1结合站点，而C.elegans P53显示相反。
结果独立于半乳糖致动启动子下的P53表达水平。通过计算在100微升培养量下降中获得的菌落数量来测量酵母生长。计算化合物的突变重新激活效应，认为野生型P53表达酵母的生长为最大可能的效果，设置为100%，而表达突变P53的细胞的生长表示零水平的重新激活。
在此示例中，Nutlin-3a 缓解了由 MDM2 共表达引起的野生型 P53 的抑制，而 PhiKan083 部分重新激活 Y220C P53 突变体。在这两种情况下，这导致酵母生长的P53依赖性减少。酵母基底细胞已被证明对研究P53蛋白质功能的价值，方面有用。
本工作中描述的协议对于评估野生型或癌症相关突变体P53对目标位点变异的转活潜力特别敏感。此外，该方法可用于识别影响P53功能的小分子，并研究P53与辅助因子的相互作用。彩色记者的使用，荧光素酶的小型化，以及生长抑制试验的结果，在成本效益和可扩展的测定，有可能为化学库筛选。
最后，在研究其他序列特异性转录因子时，可以方便地采用本工作中描述的系统。
