作为一种妊娠期较短的生物体，黑腹果蝇的胚胎是研究蛋白质及其调节剂在发育过程中的分布和定位的主要研究对象。然而，由于它们的富含脂质的胚胎和富含几丁质的绒毛膜，它们的实用性受到将胚胎安装在玻璃表面上的难度的限制。在这项工作中，我们介绍了一种实用的方法，该方法显着增强了果蝇胚胎在载玻片上的附着力，并详细介绍了我们成功组织化学，免疫组织化学和原位杂交的方法。
在执行此处所示的步骤之前，应用洗涤剂清洗载玻片，然后在自来水和蒸馏水中冲洗，然后放入烤箱中晾干。干燥的载玻片应在重铬酸钾中轻轻浸泡24小时，然后冲洗并再次干燥，然后置于95%乙醇中至少两小时。在此步骤中，您可以根据我们的方法准备进一步的载玻片或铬明矾明胶。
然后，明胶可以在使用前储存在60度的洗澡水中。要涂覆载玻片，请将少量明胶滴到载玻片的一个边缘。然后使用另一个载玻片缓慢而均匀地将明胶拖过要涂覆的载玻片表面。
这将创建一个薄而均匀的图层。在放入架子或干燥设备中储存在烤箱中以允许再完全干燥过夜或48小时之前。使用葡萄汁琼脂平板收集胚胎，一旦准备好，就可以取出葡萄汁琼脂平板。
用PBS填充板，并用软刷轻轻刷子，以去除任何附着的胚胎。将含有PBS的胚胎取出到1.5毫升离心管中，并在冰上休息。一旦胚胎在冰上固定，轻轻取出上清液PBS。
注意不要打扰管底部的胚胎。向样品中加入1 mL 50%漂白剂，轻轻摇匀两分钟。通过过滤去除漂白剂，并在PBS中洗涤胚胎三次。
准备正庚烷。准备就绪后，通过在溶液中轻轻摇动滤纸，将滤纸中的胚胎洗涤成正庚烷。让胚胎沉降在正庚烷板的底部，并将该正庚烷收集到新的1.5毫升离心管中。
向管中加入一毫升甲醇，让溶液沉淀，然后吸出正庚烷甲醇。在PBS中洗涤胚胎三到五次以除去残留的甲醇。取出这个额外的PBS，加入Bouin的固定剂，静置30到60分钟，以固定胚胎。
取出Bouin的固定剂，并在PBS中再次洗涤胚胎三次。在PBS中制备1.2%琼脂糖，并在60度水浴中保持温暖，然后通过轻轻吸出已储存的额外PBS来准备胚胎以进行嵌入。小心不要打扰底部的胚胎，然后吸出溶液底部的胚胎塞，轻轻放入瓶盖模具中。
在加入1.2%琼脂糖凝胶之前，从该模具中吸取任何额外的PBS。准备PBS溶液以储存这些琼脂糖插头。一旦琼脂糖凝固，就可以将单个插头移动到此PBS中进行存储。
在这里，我们展示了顺序脱水过程。每次孵育15分钟。然后从100%乙醇中取出，并在乙醇和二甲苯的一对一溶液中再固定15分钟。
从这种一对一的溶液中除去后，在纯二甲苯中除去一分钟。现在，组织样品已准备好移动到加热的一对一二甲苯石蜡溶液中。静置30分钟，然后最终嵌入100%石蜡中。
移至100%石蜡中的第一个，休息两个小时。在两个和三个石蜡中重复此过程。样品现在可以移动到模具中，模具中装满蜡以完成包埋过程。
果蝇胚胎的嵌入。将准备好的果蝇胚胎石蜡切片放入60度烤箱中15分钟。将它们置于100%二甲苯溶液中。
然后我们开始补液。将幻灯片放在每个溶液中三分钟。一旦载玻片在蒸馏水中，放入苏木精溶液中两分钟。
完成后，确保从载玻片中排出尽可能多的溶液。将载玻片用蒸馏水洗涤后，将载玻片在曙红中染色一分钟。最后，从曙红中取出载玻片，在蒸馏水中洗涤。
一旦这张幻灯片干净，我们现在开始最后的脱水过程。最后放入100%二甲苯中五分钟。在两种100%二甲苯的新溶液中重复该过程，并沿着载玻片的一个边缘滴下少量中性胶。
取下此盖玻片，轻轻地放在滑盖的一个边缘。首先通过放入100%二甲苯来脱蜡载玻片。一旦载玻片从蒸馏水中取出，应用1%的元素酸溶液覆盖它们。
然后，我们丢弃多余的溶液，用蒸馏水冲洗。通过将载玻片直接放入预热的溶液中。一旦完成，我们用蒸馏水冲洗载玻片，然后用0.2%氯化金着色溶液一到两分钟。
接下来，我们用3%硫代硫酸钠用蒸馏水固定组织三分钟。然后用苏木精复染色。复染后，可以用任何一管蒸馏水清洗污渍，如图所示。
然后我们进入脱水过程。然后将载玻片直接放入100%二甲苯中，然后在载玻片的角落涂抹少量中性口香糖。用盖玻片轻轻盖住。
像以前一样，通过脱蜡和二甲苯开始制备载玻片。然后在一对一的二甲苯乙醇中。一旦载玻片脱蜡，我们开始重新水化它们的组织，然后最终在PBS中。
将载玻片置于甲醇制成的0.3%过氧化氢中10分钟。然后用20 mL的目标检索溶液覆盖载玻片。然后可以将载玻片放入染色盒中。
将染色盒放入蒸笼中，确保没有溶液逸出，载玻片仍完全覆盖。请注意，污渍盒盖不应完全关闭，以免水蒸气在蒸气过程中逸出。然后在PBS-T中轻轻冲洗三次。
丢弃多余的溶液并重复该过程，这次是使用PBS。接下来，我们将载玻片在过氧化物块中孵育5至10分钟，然后在PBS-T中再次冲洗几次，然后在PBS中冲洗。准备抗体并直接滴到组织上。
然后可以将这些组织孵育或在室温下孵育四小时。二抗应在室温下孵育90分钟，用5%DAB染色2至10分钟。获得适当的颜色后，在蒸馏水中冲洗，然后在苏木精中复染。
在这种苏木精染色后，载玻片可以依次脱水。将载玻片放入100%二甲苯中，浸泡三分钟。然后将少量中性口香糖滴到载玻片的一个边缘。
放置口香糖后，取下载玻片盖，从载玻片的一个边缘轻轻放置。将一微克纯化的线性化模板DNA加入无菌无RNase反应瓶中。然后加入足够无菌的无RNase DEPC处理的双蒸馏水，使样品总体积为13微升。
然后短暂离心，在37摄氏度下孵育两个小时。对于RNase保护实验，我们建议用两微升无RNase的Dnase-1孵育15分钟以去除模板DNA。孵育步骤完成后，通过在pH值为8时加入两微升0.2摩尔EDTA来停止反应。
在本文显示的步骤之前，根据我们之前演示的实验方案，载玻片已脱蜡并重新水合。补液后，将载玻片以每升PBS0.01摩尔的pH值孵育5分钟，每次5分钟，以从组织中除去固定溶液。在PBS中冲洗后，我们接下来用每升100毫摩尔甘氨酸溶液冲洗五分钟两次，以从组织中除去游离的醛基团。
完成此步骤后，用 PBS 冲洗载玻片五分钟。接下来，在含有0.3%triton X-100的PBS中孵育15分钟，然后冲洗，然后再次孵育每微升蛋白酶K.接下来，用4%多聚甲醛和PBS在pH值为7.2时固定载玻片三分钟。然后，在用0.1摩尔三乙醇胺缓冲液pH 8孵育之前洗涤载玻片，其中含有0.25%乙酸酐。
您可以选择在此阶段倾斜盒子，以确保解决方案完全覆盖。通过将20%甘油或DEPC水添加到干杂交盒的底部来制备该盒。接下来，在20微升的预杂交溶液中覆盖载玻片。
鲑鱼的精子DNA浓度为每毫升100微克到每张载玻片。然后在42摄氏度下孵育四个小时。这是在预先准备好的加湿盒中完成的，以确保溶液在此过程中不会干燥。
在杂交后阶段，从样品中完全冲洗杂交溶液非常重要。这可以在37度下连续冲洗15分钟，使用四倍浓度SSC，两倍浓度一倍浓度，0.5倍浓度和0.1倍浓度SSC溶液。每个在37摄氏度下孵育15分钟。
完成后，用PBS洗涤三次，每次五分钟，然后加入洗涤缓冲液。在进行后续步骤之前，应冲洗洗涤缓冲液一分钟，确保在加入下一个溶液之前，洗涤缓冲液从载玻片中完全干燥。向每张载玻片中加入100毫升阻塞溶液，并将载玻片孵育30分钟。
最好在无光的环境中进行，以确保良好的染色效果。接下来，将载玻片在20 mL抗体溶液中再次孵育30分钟。将抗体溶液直接涂抹在载玻片上，以完全覆盖您的组织。
孵育完成后，施用100毫升洗涤缓冲液。在无光照条件下孵育15分钟，以除去未结合的抗体偶联物。取出洗涤缓冲液。
接下来，应用20毫升检测缓冲液，并使其孵育约4分钟。四分钟后，取出检测缓冲区。干燥载玻片以确保没有额外的溶液，并加入10毫升新鲜制备的彩色底物溶液。
该反应在几分钟内开始，但在16小时后完成。因此，允许在无光照的条件下孵育一段时间。一旦检测到条带的所需斑点，用50毫升TE缓冲液洗涤载玻片以停止反应。
然后完成我们之前展示的中性口香糖脱水过程和安装过程。图1和图2展示了铬铝明胶包衣方法在发育中的果蝇胚胎中用于石蜡切片以及FKBP12和DmFKBP12表达谱的包埋方法。图三显示了在合胞细胞胚芽孢子阶段检测到的抗体FKBP12的蛋白质分布。
从这些组织化学结果中可以看出，FKBP12表达在合胞胚芽孢子虫中的极化程度较低，然后开始在滋养外胚层上皮下方的基底膜内定位于梯度，在前极和后极中发现更多的表达。图四，遵循果蝇胚胎的早期和晚期气体关系阶段，显示FKBP12蛋白被限制在原始胚胎组织的某些结构成分上。细胞外分布少于在早期和晚期胃胚胎阶段观察到的分布。
有趣的是，上述动态蛋白质分布并不伴随着FKBP12的MRI水平的相应变化，如图五所示。表明蛋白质表达是仍然未知的转录后分子机制的结果。Ryanodine受体介导的钙信号传导是脊椎动物和无脊椎动物的许多生理和病理过程的基本途径。
已知该基因的突变会导致许多生理紊乱，导致疾病或早期心脏死亡。然而，该基因在早期果蝇发育中的作用一直难以研究。作为胚胎的中转成分，富含脂质的胚胎和富含几丁质的绒毛膜，使得研究果蝇早期发育中的蛋白质和胚胎表达变得困难。
本文中描述的载玻片包衣，胚胎包埋和免疫组织化学技术使我们能够详细研究ryanodine受体蛋白和mRNA的动态分布。我们分享这些技术，并希望它们能让其他人在果蝇的早期发育阶段研究其他蛋白质。
