3D生物反应器培养大规模制备滑液间充质干细胞来源外泌体

我们提出了一种协议，使用我们的3D生物反应器从滑液间充质干细胞中产生大量GMP级外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究和临床关节炎治疗。演示该程序的将是梁玉杰博士。

通过在 1， 500 倍 G 下以 4 摄氏度离心滑液 10 分钟，开始收集人间充质细胞或 MSC。离心后，弃去上清液并用10毫升PBS重悬细胞沉淀。将重悬的细胞在 1， 500 倍 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟并丢弃 PBS，然后用 10 毫升人 MSC 培养基重悬沉淀，细胞密度为 10 倍至每毫升第四个细胞的五倍，然后将悬浮液铺在 100 毫米培养皿中。

将培养皿在含有 37% 二氧化碳的气氛中孵育 5%。两周后，收集细胞培养上清液以使用流式细胞术鉴定滑液间充质干细胞或SF-MSC。为此，通过在 1， 000 倍 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟来消化第三代 SF-MSC 的第三代传代。

然后，在收集细胞沉淀之前丢弃上清液。接下来，将400微升封闭缓冲液以五乘以10到第四的浓度添加到细胞沉淀中，并使沉淀在室温下静置15分钟。15分钟后，如前所述离心细胞悬液，然后将分离的沉淀重悬于100微升1X PBS中。

如手稿中所述，以每管1:100的稀释比例加入1微升单克隆荧光抗体，并将试管置于室温下孵育30分钟。孵育后，用1X PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于100微升1X PBS中。然后，使用红色和FITC通道在流式细胞仪上检测多达10， 000个细胞中的荧光团。

为了制备微载体，在室温下以每克50毫克的浓度在1X DPBS中膨胀并水合0.75克微载体至少三个小时。然后，倒出上清液以在新鲜的DPBS中洗涤微载体五分钟。用每克 50 毫克微载体的新鲜 1X DPBS 替换培养基后，通过在 121 摄氏度下以每平方英寸 15 磅的速度高压灭菌 15 分钟对微载体进行灭菌。

然后，在倾析上清液之前让灭菌的微载体沉淀。在室温下以每克50毫克微载体的浓度冲洗培养基中的微载体。当微载体沉降时，弃去上清液。

要制备灌注生物反应器，如前所述通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。完成后，计算SF-MSC的数量，以将2.5乘以10分配给第七个SF-MSC，并将微载体分配给注入250毫升GMP级MSC培养基的生物反应器。将生物反应器置于含有5%二氧化碳的培养箱中，温度为37摄氏度，速度为每分钟15转。

每六天更换一次培养基。14天后，收集细胞培养上清液和微载体进行进一步分析。将细胞培养上清液在4摄氏度下以300倍G离心10分钟，并在丢弃细胞碎片的同时收集上清液。

在4摄氏度下，依次将上清液以2， 000倍G离心10分钟，然后在10， 000倍G下离心30分钟，以丢弃较大的囊泡并收集沉淀。将沉淀重悬于40毫升PBS中后，在4摄氏度下以120， 000倍G离心细胞悬液70分钟。然后，将收集的含有外泌体的沉淀重悬于500微升PBS中。

用无菌PBS稀释新鲜分离的外泌体样品至每毫升10至第七至10至第九颗粒的浓度，并在每分钟30微升和24.4至24.5摄氏度的每次运行中注入500微升样品进入纳米颗粒跟踪分析或NTA系统。根据制造商的协议手动设置捕获和分析系统。通过激光散射可视化粒子，并在数字视频上捕获它们的布朗运动。

接下来，使用软件分析录制的录像带，每次运行至少跟踪 200 个单独的粒子。对于蛋白质印迹，将300微升裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物加入外泌体中，通过上下移液混合进行混合。然后，让其在冰上静置 20 分钟。

将混合物在4摄氏度下以9，391倍G离心10分钟后，使用蛋白质测定试剂盒测量上清液中的蛋白质浓度。测定后，用100微升4X蛋白质上样缓冲液在100摄氏度下加热样品10分钟。接下来，以每毫升10毫克的浓度加载15微升蛋白质，通过凝胶电泳在120伏下运行70分钟，并在100伏特下在4摄氏度下电印迹60分钟。

通过荧光蛋白质印迹检测非外泌体特异性标志物，例如calnexin和外泌体生物标志物，例如CD9，CD63和CD81。流式细胞术分析显示，培养的SF-MSCsCD34、CD45和HLA-DR阴性，CD73、CD90和CD105阳性，符合MSCs鉴定标准。

在倒置显微镜下，注意到SF-MSCs在微载体上增殖。与2D培养相比，SF-MSC从6天开始在3D培养中增殖更快。使用蛋白质印迹法鉴定来自2D和3D培养的SF-MSC的外泌体，发现外泌体表达CD63，CD9和CD81，而钙连接蛋白呈阴性。

纳米细胞分析表明，2D和3D外泌体的直径约为120纳米。透射电子显微镜分析揭示了2D和3D外泌体的形态，大致呈球状囊泡。使用NTA分析，分析了30至160纳米尺寸颗粒的浓度。

3D培养后，颗粒浓度为每毫升10至6的4.0倍。然而，在2D培养后，相同大小颗粒的浓度为每毫升10至6的2.5倍。此外，3D培养比2D培养产生更多的外泌体蛋白。

代表性分析显示原代软骨细胞内化了Dil标记的外泌体。Dil标记的外泌体进入原代软骨细胞，在三小时时达到峰值。体外递送研究表明，外泌体可以将磺基-花青3标记的microRNA-140递送至软骨细胞。

电镀细胞，在生物反应器中开始反应以及上清液是该协议中最重要的步骤。3D培养通常用于贴壁细胞的大规模培养。其他方法，如自旋柔性也可用于外泌体的大规模生产。

我们的方法提高了外泌体的产量，从而实现了基于MSC外泌体的临床前应用。