Apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando nosso biorreator 3D. Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da artrite. Demonstrando o procedimento será o Dr. Yujie Liang.
Comece a coletar as células mesenquimais humanas, ou MSCs, centrifugando o líquido sinovial a 1, 500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 10 mililitros de PBS. Centrifugar as células ressuspensas a 1, 500 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o PBS antes de ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de cinco vezes 10 para a quarta célula por mililitro e, em seguida, chapear a suspensão em um prato de 100 milímetros.
Incubar o prato a 37 graus Celsius numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Após duas semanas, coletar o sobrenadante da cultura celular para identificar células-tronco mesenquimais do líquido sinovial, ou SF-MSCs, usando citometria de fluxo. Para fazer isso, digerir a passagem de terceira geração três de SF-MSCs por centrifugação a 1.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, descarte o sobrenadante antes de coletar o pellet celular. Em seguida, adicione 400 microlitros do tampão de bloqueio ao pellet da célula na concentração de cinco vezes 10 ao quarto e deixe o pellet repousar por 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, centrifugar a suspensão celular conforme descrito anteriormente e, em seguida, ressuspender o pellet separado em 100 microlitros de PBS 1X.
Adicione um microlitro do anticorpo fluorescente monoclonal a uma razão de diluição de 1:100 por tubo, conforme descrito no manuscrito, e coloque o tubo para incubação à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, lave as células duas vezes com 1X PBS e ressuspenda as células em 100 microlitros de 1X PBS. Em seguida, detecte os fluoróforos em até 10.000 células em um citômetro de fluxo usando canais vermelhos e FITC.
Para preparar os microcarreadores, inchar e hidratar seco 0,75 gramas dos microtransportadores em 1X DPBS na concentração de 50 miligramas por grama por pelo menos três horas à temperatura ambiente. Em seguida, decante o sobrenadante para lavar os microtransportadores em DPBS fresco por cinco minutos. Depois de substituir o meio por 1X DPBS fresco a 50 miligramas dos microtransportadores por grama, esterilize os microtransportadores por autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos a 15 libras por polegada quadrada.
Em seguida, permita que os microportadores esterilizados se depositem antes de decantar o sobrenadante. Enxaguar os microcarreadores no meio de cultura na concentração de 50 miligramas dos microcarreadores por grama à temperatura ambiente. Quando os microportadores estiverem assentados, descarte o sobrenadante.
Para preparar o biorreator de perfusão, esterilize o biorreator por autoclave, conforme descrito anteriormente. Quando terminar, conte o número de SF-MSCs para alocar 2,5 vezes 10 para o sétimo SF-MSCs e microportadores para o biorreator perfundido com 250 mililitros do meio de cultura MSC de grau GMP. Coloque o biorreator em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a uma velocidade de 15 rotações por minuto.
Mude o meio de cultura a cada seis dias. Após 14 dias, coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise posterior. Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e coletar o sobrenadante enquanto descarta os detritos celulares.
A quatro graus Celsius, centrífuga sequencial do sobrenadante a 2.000 vezes G por 10 minutos e depois a 10.000 vezes G por 30 minutos para descartar as vesículas maiores e coletar o pellet. Depois de ressuspender o pellet em 40 mililitros de PBS, centrifugar a suspensão da célula a 120.000 vezes G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuscite o pellet coletado contendo exossomos em 500 microlitros de PBS.
Diluir as amostras de exossomos recém-isoladas com PBS estéril até a concentração de 10 a sétima a 10 a nona partículas por mililitro e injetar 500 microlitros da amostra para cada corrida na análise de rastreamento de nanopartículas, ou sistema NTA, a 30 microlitros por minuto e 24,4 a 24,5 graus Celsius. Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.
Em seguida, analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software, rastreando pelo menos 200 partículas individuais por corrida. Para Western blotting, adicione 300 microlitros do tampão de lise e coquetel de inibidores de protease aos exossomos com mistura por pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, deixe o ficar no gelo por 20 minutos.
Após a centrifugação da mistura a 9, 391 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, meça a concentração de proteína no sobrenadante usando um kit de ensaio de proteína. Após o ensaio, aqueça a amostra com 100 microlitros de tampão de carregamento de proteína 4X a 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, carregue 15 microlitros de proteínas a uma concentração de 10 miligramas por mililitro para funcionar por eletroforese em gel a 120 volts por 70 minutos e eletro-blotting a 100 volts por 60 minutos a quatro graus Celsius.
Detecte os marcadores específicos não exossomos, como a calexina, e os biomarcadores exossômicos, como CD9, CD63 e CD81, por Western blotting fluorescente. No estudo, a citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas foram negativas para CD34, CD45 e HLA-DR e positivas para CD73, CD90 e CD105, atendendo aos critérios de identificação das CTMs.
Sob microscopia invertida, observou-se que as SF-MSCs proliferam em microportadores. O SF-MCC proliferou na cultura 3D mais rapidamente a partir de seis dias em comparação com a cultura 2D. Os exossomos de SF-MSCs de cultura 2D e 3D foram identificados usando Western blotting e os exossomos expressaram CD63, CD9 e CD81 enquanto eram negativos para a calexina.
A análise de nanócitos demonstrou que o diâmetro dos exossomos 2D e 3D era de aproximadamente 120 nanômetros. A análise microscópica eletrônica de transmissão revelou a morfologia dos exossomos 2D e 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidais. Usando a análise NTA, a concentração de partículas de 30 a 160 nanômetros foi analisada.
Após a cultura 3D, a concentração de partículas foi de 4,0 vezes 10 a seis por mililitro. No entanto, após a cultura 2D, a concentração de partículas do mesmo tamanho foi de 2,5 vezes 10 a seis por mililitro. Além disso, a cultura 3D produziu mais proteína exossomótica do que a cultura 2D.
A análise representativa mostra a internalização de exossomos marcados com Dil por condrócitos primários. Exossomos marcados com dil que entraram nos condrócitos primários podem ser vistos com um pico em três horas. O estudo de entrega in vitro demonstrou que os exossomos poderiam fornecer microRNA-140 marcado com sulfo-cianinina3 aos condrócitos.
Planear as células, iniciar a reação no biorreator e o do sobrenadante são os passos mais importantes deste protocolo. A cultura 3D é comumente usada para cultura em larga escala de células aderentes. Outros métodos, como o spin flex, também podem ser usados para a produção em larga escala de exossomos.
Nosso método melhora o rendimento dos exossomos, permitindo assim a aplicação pré-clínica baseada em exossomos de MSC.
