Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit mit unserem 3D-Bioreaktor. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthritisbehandlung verwendet werden. Das Verfahren wird von Dr. Yujie Liang demonstriert.
Beginnen Sie mit der Sammlung der menschlichen mesenchymalen Zellen oder MSCs, indem Sie die Synovialflüssigkeit bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 10 Milliliter PBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen bei 1 500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie PBS, bevor Sie das Pellet mit 10 Milliliter humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von fünf mal 10 bis zur vierten Zelle pro Milliliter resuspendieren und dann die Suspension in einer 100-Millimeter-Schale beschichten.
Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Wochen sammeln Sie den Zellkulturüberstand, um mesenchymale Stammzellen der Synovialflüssigkeit oder SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren. Um dies zu tun, verdauen Sie die dritte Generation der Passage drei von SF-MSCs durch Zentrifugation bei 1.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet sammeln. Als nächstes fügen Sie dem Zellpellet 400 Mikroliter des blockierenden Puffers in der Konzentration von fünfmal 10 bis zum vierten hinzu und lassen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie zuvor beschrieben und resuspendieren Sie dann das abgetrennte Pellet in 100 Mikrolitern 1X PBS.
Fügen Sie einen Mikroliter des monoklonalen fluoreszierenden Antikörpers in einem Verdünnungsverhältnis von 1:100 pro Röhrchen hinzu, wie im Manuskript beschrieben, und stellen Sie das Röhrchen zur Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten ein. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter 1X PBS. Anschließend detektieren Sie die Fluorophore in bis zu 10.000 Zellen auf einem Durchflusszytometer mit roten und FITC-Kanälen.
Zur Herstellung der Mikroträger quellen und hydratisieren Sie 0,75 Gramm der Mikroträger in 1X DPBS in der Konzentration von 50 Milligramm pro Gramm für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie dann den Überstand, um die Mikroträger fünf Minuten lang in frischem DPBS zu waschen. Nach dem Ersetzen des Mediums durch frisches 1X DPBS bei 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten bei 15 Pfund pro Quadratzoll.
Lassen Sie dann die sterilisierten Mikroträger absetzen, bevor Sie den Überstand dekantieren. Die Mikroträger im Kulturmedium werden bei einer Konzentration von 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm bei Raumtemperatur gespült. Wenn die Mikroträger abgesetzt sind, verwerfen Sie den Überstand.
Um den Perfusionsbioreaktor vorzubereiten, sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren, wie zuvor beschrieben. Wenn Sie fertig sind, zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs, um 2,5 mal 10 den siebten SF-MSCs und Mikroträger dem Bioreaktor zuzuweisen, der mit 250 Milliliter des GMP-konformen MSC-Kulturmediums perfundiert ist. Stellen Sie den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute.
Wechseln Sie das Kulturmedium alle sechs Tage. Nach 14 Tagen sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger zur weiteren Analyse. Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand, während Sie die Zelltrümmer entsorgen.
Bei vier Grad Celsius zentrifugieren Sie den Überstand nacheinander bei 2.000 mal G für 10 Minuten und dann bei 10.000 mal G für 30 Minuten, um die größeren Vesikel zu verwerfen und das Pellet zu sammeln. Nach dem Resuspendieren des Pellets in 40 Milliliter PBS zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120.000 mal G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann resuspendieren Sie das gesammelte Pellet mit Exosomen in 500 Mikroliter PBS.
Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem PBS auf die Konzentration von 10 bis siebten bis 10 bis neunten Partikeln pro Milliliter verdünnt und 500 Mikroliter der Probe für jeden Durchlauf in die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA-System) bei 30 Mikrolitern pro Minute und 24,4 bis 24,5 Grad Celsius injiziert. Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.
Als nächstes analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit einer Software und verfolgen mindestens 200 einzelne Partikel pro Lauf. Für das Western Blotting fügen Sie 300 Mikroliter des Lysepuffer- und Proteaseinhibitor-Cocktails zu den Exosomen hinzu, indem Sie auf und ab pipettieren. Dann lassen Sie sie 20 Minuten auf Eis stehen.
Nach Zentrifugation der Mischung bei 9,391 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird die Proteinkonzentration im Überstand mit einem Proteinassay-Kit gemessen. Nach dem Assay erhitzen Sie die Probe mit 100 Mikrolitern 4X-Proteinladepuffer bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes laden Sie 15 Mikroliter Proteine in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter, um durch Gelelektrophorese bei 120 Volt für 70 Minuten und Elektro-Blotting bei 100 Volt für 60 Minuten bei vier Grad Celsius zu laufen.
Erkennen Sie die nicht-exosomenspezifischen Marker wie Calnexin und die exosomalen Biomarker wie CD9, CD63 und CD81 durch fluoreszierendes Western Blotting. In der Studie wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass die kultivierten SF-MSCs negativ für CD34, CD45 und HLA-DR und positiv für CD73, CD90 und CD105 waren und die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten.
Unter inverser Mikroskopie wurde festgestellt, dass sich die SF-MSCs auf Mikroträgern vermehren. Die SF-MSC vermehrte sich in der 3D-Kultur ab sechs Tagen schneller als die 2D-Kultur. Die Exosomen aus SF-MSCs der 2D- und 3D-Kultur wurden mittels Western Blotting identifiziert und die Exosomen exprimierten CD63, CD9 und CD81, während sie für Calnexin negativ waren.
Die Nanozytenanalyse zeigte, dass der Durchmesser von 2D- und 3D-Exosomen etwa 120 Nanometer betrug. Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse zeigte die Morphologie von 2D- und 3D-Exosomen und zeigte annähernd kugelförmige Vesikel. Mittels NTA-Analyse wurde die Konzentration von 30 bis 160 Nanometer großen Partikeln analysiert.
Nach 3D-Kultur betrug die Partikelkonzentration 4,0 mal 10 zu sechs pro Milliliter. Nach der 2D-Kultur betrug die Konzentration der gleich großen Partikel jedoch 2,5 mal 10 zu den sechs pro Milliliter. Darüber hinaus produzierte die 3D-Kultur mehr Exosomenprotein als die 2D-Kultur.
Die repräsentative Analyse zeigt die Internalisierung von Dil-markierten Exosomen durch primäre Chondrozyten. Dil-markierte Exosomen, die in primäre Chondrozyten eingedrungen sind, können mit einem Peak nach drei Stunden gesehen werden. In-vitro-Verabreichungsstudie zeigte, dass Exosomen Sulfo-Cyanin3-markierte microRNA-140 an Chondrozyten abgeben können.
Die Beschichtung der Zellen, das Starten der Reaktion im Bioreaktor und die des Überstands sind die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll. Die 3D-Kultur wird häufig für die großflächige Kultur adhärenter Zellen verwendet. Andere Methoden wie Spinflex können auch für die großtechnische Produktion von Exosomen verwendet werden.
Unsere Methode verbessert die Ausbeute an Exosomen und ermöglicht so eine MSC-Exosom-basierte präklinische Anwendung.
