Nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide de notre bioréacteur 3D. Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrite. La démonstration de la procédure sera le Dr Yujie Liang.
Commencez à recueillir les cellules mésenchymateuses humaines, ou CSM, en centrifugeant le liquide synovial à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule avec 10 millilitres de PBS. Centrifuger les cellules en suspension à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le PBS avant de remettre en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu de culture CSM humain à une densité cellulaire de cinq fois 10 à la quatrième cellule par millilitre, puis plaquer la suspension dans une boîte de 100 millimètres.
Incuber le plat à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Après deux semaines, prélever le surnageant de culture cellulaire pour identifier les cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial, ou SF-MSC, en utilisant la cytométrie en flux. Pour ce faire, digérer le passage de troisième génération de SF-MSC par centrifugation à 1 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, jetez le surnageant avant de recueillir la pastille de cellule. Ensuite, ajoutez 400 microlitres du tampon de blocage à la pastille de cellule à la concentration de cinq fois 10 à la quatrième et laissez la pastille reposer pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, centrifuger la suspension cellulaire comme décrit précédemment, puis remettre en suspension la pastille séparée dans 100 microlitres de 1X PBS.
Ajouter un microlitre de l’anticorps fluorescent monoclonal à un rapport de dilution de 1:100 par tube, comme décrit dans le manuscrit, et placer le tube pour l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, laver les cellules deux fois avec 1X PBS et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de 1X PBS. Ensuite, détectez les fluorophores dans jusqu’à 10 000 cellules sur un cytomètre en flux en utilisant les canaux rouge et FITC.
Pour préparer les microporteurs, gonfler et hydrater à sec 0,75 gramme des microporteurs dans 1X DPBS à la concentration de 50 milligrammes par gramme pendant au moins trois heures à température ambiante. Ensuite, décanter le surnageant pour laver les microporteurs dans du DPBS frais pendant cinq minutes. Après avoir remplacé le milieu par du 1X DPBS frais à 50 milligrammes de microporteurs par gramme, stérilisez les microporteurs par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes à 15 livres par pouce carré.
Ensuite, laissez les microporteurs stérilisés se déposer avant de décanter le surnageant. Rincer les microtransporteurs dans le milieu de culture à la concentration de 50 milligrammes de microtransporteurs par gramme à température ambiante. Lorsque les microporteurs sont installés, jetez le surnageant.
Pour préparer le bioréacteur de perfusion, stérilisez le bioréacteur par autoclavage comme décrit précédemment. Lorsque cela est fait, comptez le nombre de SF-MSC à allouer 2,5 fois 10 aux septièmes SF-MSC et microtransporteurs au bioréacteur perfusé avec 250 millilitres du milieu de culture MSC de qualité GMP. Placez le bioréacteur dans un incubateur contenant 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius à une vitesse de 15 rotations par minute.
Changez le milieu de culture tous les six jours. Après 14 jours, prélever les surnageants de culture cellulaire et les microporteurs pour une analyse plus approfondie. Centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et recueillir le surnageant tout en éliminant les débris cellulaires.
À quatre degrés Celsius, centrifuger séquentiellement le surnageant à 2 000 fois G pendant 10 minutes, puis à 10 000 fois G pendant 30 minutes pour éliminer les vésicules plus grosses et recueillir la pastille. Après avoir remis en suspension la pastille dans 40 millilitres de PBS, centrifuger la suspension cellulaire à 120 000 fois G pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, remettez en suspension la pastille collectée contenant des exosomes dans 500 microlitres de PBS.
Diluer les échantillons d’exosomes fraîchement isolés avec du PBS stérile à la concentration de 10 à la septième à 10 à la neuvième particules par millilitre et injecter 500 microlitres de l’échantillon pour chaque passage dans l’analyse de suivi des nanoparticules, ou système NTA, à 30 microlitres par minute et 24,4 à 24,5 degrés Celsius. Réglez manuellement le système de capture et d’analyse selon le protocole du fabricant. Visualisez les particules par diffusion laser de la lumière et capturez leur mouvement brownien sur vidéo numérique.
Ensuite, analysez les bandes vidéo enregistrées à l’aide d’un logiciel, en suivant au moins 200 particules individuelles par exécution. Pour le Western blot, ajoutez 300 microlitres du tampon de lyse et du cocktail d’inhibiteurs de protéase aux exosomes en mélangeant en pipetant de haut en bas. Ensuite, laissez le laisser reposer sur la glace pendant 20 minutes.
Après centrifugation du mélange à 9 391 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, mesurer la concentration de protéines dans le surnageant à l’aide d’un kit de dosage des protéines. Après le test, chauffer l’échantillon avec 100 microlitres de tampon de charge protéique 4X à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, chargez 15 microlitres de protéines à une concentration de 10 milligrammes par millilitre pour faire fonctionner par électrophorèse sur gel à 120 volts pendant 70 minutes et électrobuvardage à 100 volts pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.
Détecter les marqueurs spécifiques non exosomes, tels que la calnexine et les biomarqueurs exosomiques tels que CD9, CD63 et CD81 par transfert Western fluorescent. Dans l’étude, la cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-MSC en culture étaient négatives pour CD34, CD45 et HLA-DR, et positives pour CD73, CD90 et CD105, répondant aux critères d’identification des CSM.
En microscopie inversée, on a remarqué que les SF-MSC prolifèrent sur les microporteurs. Le SF-MSC a proliféré dans la culture 3D plus rapidement à partir de six jours par rapport à la culture 2D. Les exosomes des SF-MSC de culture 2D et 3D ont été identifiés par transfert Western et les exosomes se sont avérés exprimer CD63, CD9 et CD81 tout en étant négatifs pour la calnexine.
L’analyse des nanocytes a démontré que le diamètre des exosomes 2D et 3D était d’environ 120 nanomètres. L’analyse au microscope électronique à transmission a révélé la morphologie des exosomes 2D et 3D, montrant des vésicules grossièrement sphéroïdales. À l’aide de l’analyse NTA, la concentration de particules de 30 à 160 nanomètres a été analysée.
Après culture 3D, la concentration de particules était de 4,0 fois 10 à six par millilitre. Cependant, après la culture 2D, la concentration de particules de même taille était de 2,5 fois 10 à six par millilitre. De plus, la culture 3D a produit plus de protéines exosomiques que la culture 2D.
L’analyse représentative montre l’internalisation des exosomes marqués par Dil par les chondrocytes primaires. Les exosomes marqués par Dil entrés dans les chondrocytes primaires peuvent être vus avec un pic à trois heures. Une étude in vitro a démontré que les exosomes pouvaient délivrer du microARN-140 marqué par la sulfo-cyanine3 aux chondrocytes.
Le placage des cellules, le démarrage de la réaction dans le bioréacteur et le surnageant sont les étapes les plus importantes de ce protocole. La culture 3D est couramment utilisée pour la culture à grande échelle de cellules adhérentes. D’autres méthodes telles que le spin flex peuvent également être utilisées pour la production à grande échelle d’exosomes.
Notre méthode améliore le rendement des exosomes, permettant ainsi une application préclinique basée sur les exosomes MSC.
