实时活体内多光子显微镜可可视化聚焦超声和微气泡处理，以提高血脑屏障通透性

在微气泡存在下进行超声暴露已成为一种有效的方法，可以短暂地和局部增加血脑屏障的通透性。通常，血脑屏障会阻碍几种脑部疾病的潜在药物的输送。超声处理后，注射的微气泡开始振荡并在血管壁上引起应变，打开紧密的连接处并最终允许药物穿过血脑屏障在临床前模型中，超声和微气泡治疗的效果通常通过造影剂增强磁共振成像或通过研究染料的离体外渗来研究。

这种方法的缺点是无法获得超声波暴露期间和之后的实时响应。大脑的活体多光子成像为实时研究这些影响提供了机会。在下面的视频中，我们将逐步介绍如何在小鼠中放置颅窗，并使用安装在颅骨上的环形换能器进行超声微气泡治疗。

该过程可实现并发超声处理和体内多光子成像。开始准备颅窗手术和超声微泡治疗所需的材料。在本视频中，我们展示了一种急性非恢复性颅窗手术。

对于慢性恢复颅窗手术，需要消毒工具和材料，无菌手术空间和适当的药物。手术前进行麻醉和镇痛。取下头上的毛皮。

将动物置于立体定位框架中。将导管插入尾静脉进行葡聚糖和微泡注射。使用热源将动物的核心温度保持在37度。

在这里，我们使用的是装满温水的手套。要去除头皮，请使用镊子将皮肤抬起眼睛之间的皮肤，然后沿着矢状缝合线切开。用棉签取出覆盖颅骨外表面的骨膜。

然后标记颅骨上颅窗的所需位置，并开始沿着轮廓钻孔。为了防止颅骨在钻孔过程中过热，请使用注射器将生理盐水滴到颅骨上，或涂抹一块浸泡在生理盐水中的手术海绵。在钻孔和冷却颅骨之间交替。

通过对骨岛施加轻柔的压力来检查钻孔进度。使用一对镊子去除骨岛。通过使用预先浸泡在盐水中的手术海绵，确保大脑保持湿润。

要放置颅窗，请将一滴生理盐水滴在盖玻片的一侧，然后将其放在颅骨上的孔上。在盖玻片的周围铺上一层胶水，将其附着在头骨上。一旦胶水完全干燥，将琼脂糖溶液沉积在窗户上，然后将传感器放在顶部。

施加坚定的压力，使换能器和颅窗之间的琼脂糖最少。当琼脂糖冷却到类似果冻的稠度时，从探头盖玻片的周长中切除多余的琼脂糖。沿着换能器盖玻片的周长铺一层胶水，将其粘附在头骨上。

胶水完全干燥后，将动物置于显微镜的物镜下。确保物镜不会与探头或盖玻片碰撞。在多光子显微镜中选择一个视场。

设置脉管系统的成像扫描并开始超声处理。对于该协议，我们使用环形传感器，其驱动频率为0.82兆赫兹，机械索引为0.2至0.4的10毫秒周期，脉冲重复频率在1到4赫兹之间。Sonovue微泡以每公斤一毫升的剂量注射。

成功的超声微气泡治疗可以通过荧光葡聚糖从血管内到血管外腔的外渗来检测，表明BBB通透性增加。为了评估右旋糖泄漏作为药物递送的代表性模型的动力学，可以使用MATLAB等工具评估血管内和血管外间隙之间的信号强度。为了评估超声微气泡处理引起的血管变化，可以在超声微气泡处理之前，期间和之后测量目标血管的直径。

可以使用 ImageJ、FIJI 或编程工具等软件进行图像分析。在这里，Imaris用于血管分割和分类。大脑活体多光子显微镜与环形换能器相结合，提供了一种以高空间和时间分辨率实时监测超声微气泡处理诱导的影响的方法。

可以获得定量和定性数据来研究，例如，外渗动力学和血管变化。这里介绍的实验方法可以应用于几种研究模型和各种超声应用。