このビデオは、凍結電子断層撮影のための酵母サルモネラ菌の調製に焦点を当てる 細胞培養から凍結電子断層撮影サッカロミセスセレビシエが懸濁液中のイオン標本調製のために栽培されるワークフローを経て行きます。 細胞培養用培地に抽出された10ミリリットルの無菌酵母の薄層流箱内の無菌状態で働くことを推奨され、滅菌20%グルコースの1ミリリットルの滅菌栽培フラスコを添加して添加する 栽培培地1つの酵母コロニーを持つフラスコは、栽培プレートから慎重に摘み取られ、その後、ホイルで覆われ、培養細胞培養物を分散させてよく混合して培養し、指数関数的な相に達するまで30度で培養し、酵母細胞培養物が指数関数相に達するまで30度で培養し、細胞の物理的密度が指数関数相に成長し、細胞の物理的密度が指数関数相に成長するまで、細胞の物理的な密度が指数関数性相および細胞密度が測定されるまで、1つの酵母コロニーを慎重に選んだ。参照サンプルとしてクリーンな培地に対する保持計計細胞培養は、ブレンシュ凍結電気顕微鏡グリッド表面が洗浄され、プラズマグリッドによる細胞懸濁液の適用のために活性化される前に、グリセロールの5%に加えてOD1またはOD30に集中し、炭素側に面したグロー放電チャンバーに配置され、プラズマクリーニングの手順は現在30〜45秒のEMグリッドに設定されており、細胞細胞細胞の準備ができているEMグリッド上の酵母細胞懸濁液のガラス化は、Vitrobotマシンを使用して液体エタンに凍結するブランシュによって行われ、液体エタンの調製は、液体窒素EMグリッドで冷却された金属カップでエタンガスを液化することによって行われ、後ろからろ紙でブロット紙で、Vitrobotチャンバーの内部の温度を曲げた非接着プラスチックによって行われます100%の待ち時間に18度と湿度、ブロット時間とブロット力がVitrobotスクリーンに設定されているグロー放電グリッドは、Vitrobotピンセットによって選ばれ、サッカロミセスセレビシエサスペンションの3ポイント5マイクロリットルがVitrobot気候チャンバーの内部の炭素側に適用される機器に取り付けられていますガラス化された細胞を持つ液体エタン電気顕微鏡グリッドに液体窒素条件下で貯蔵されるか、ガラス化された細胞を持つクライオSEM顕微鏡グリッドにロードするためのグリッドカートリッジに取り付けられ、Cクリップリングがクリッピングツールに取り付けられ、液体窒素グリッドで冷却されたCクリップリング標本は、ラミラ調製のための特別なグリッドボックスに配置され、二重ビームFIB / SEM顕微鏡にロードされ、クライオステージ調製室ローディングポットで適切に冷却され、シャトルと呼ばれる液体窒素サンプルホルダーで満たされ、貯蔵デュワーからポットに移された標本と同様にグリッドボックスを冷却し、グリッドは貯蔵デュワーからポットに2つのスロットに配置されますFIBグリッドカートリッジを使用する場合に上向きのセルを持つシャトルカーボン側は、グリッドカートリッジの切り取りが慎重に12時に調整され、シャトルグリッドはネジで締め付け、シャトルはローディングポジションローディングポットに反転し、リディングポットで蓋をして転送チャンバーで覆われ、蓋の上部に配置され、通してポンプで送られます グリッド付きの低真空シャトルはロッドに留められており、準備室に集められた小さな移送チャンバー室の内部に閉じ込め、高真空SEMチャンバーステージのクライオステージに挿入され、ガス注入システムの針を挿入するグリッドの中心位置に4ミリメートル移動し、放射線損傷に対する生物学的標本の保護層を作成します。イオンビームフライスグリッドは、その後、無機金属の薄いベールでコーティングされたスパッターであり、細胞クラスターまたは単層におけるラメラの有形イオンビームフライスリングが数ステップで行われる生体材料に導電層を作成し、目的のミリング角度領域に移動し、上部および底部の粉砕パターンが作成された粗いラメラはFIB電流の徐々に減少して粉砕され、ラメラの厚さのラメラの厚さはラメラの研磨の仕上げです上段パターンと低いFIB電流で行われ、フロントエンドの損傷を避け、ラメラ表面電子ビームのカーテン効果は、最終的な研磨されたラメラの進行を示し、最終的な研磨されたラメラの厚さは、セルクラスタで粉砕されたラメラの図と短所を持つ単層の電子ビームの透過のために250ナノメートル未満である必要があることがわかります。ラマリを備えた両方のサンプルタイプのグリッドは、準備チャンバーを通して非常に穏やかに移され、準備室を通してローディングポットに戻って冷却され、粉砕されたラマリグリッドの氷の汚染を避けるために新鮮で清潔な液体窒素で満たされ、粉砕されたラマリを有するグリッドボックス標本に戻され、最終的にトランスミッション電子凍結顕微鏡グリッドがTEMオートカソジェットに挿入される前に90度回転させられなければならないことを確認するTEMチルトアクセスに対してラメラの適切な向きを確保するために、ラミリがスクリーニングされ、クライオ電子断層データの取得対象領域が局所的なラメラ主軸は、高傾斜角で右の視野を見るために顕微鏡の傾き軸に垂直であり、トモ図を収集するために使用されるクライオ電子断層撮影データを収集するために使用されます。ソフトウェア このプロトコルでは、クライオに焦点を合わせるイオンビームミリングを使用してラメラマイクロマシン用の酵母細胞サンプルを効率的に調製する方法と、電子断層撮影データと細胞ラマリを準備および処理する方法を示しました
