硅氮化物膜的细胞培养和同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备

新设计的同步加速器X射线荧光纳米探头允许对样品的元素分布进行可视化。使用低温方法是降低X射线辐射损伤的强制性方法。因此，快速冷冻对于获得冷冻水合细胞以优化细胞结构及其化学完整性至关重要。

同步加速器研究的细胞制剂的特异性导致该协议的优化，用于获得冷冻水合细胞单层。视觉演示对于了解如何操作细胞单层样品以实现嵌入在薄冰层中的可重复低温固定细胞非常重要。要准备氮化硅膜支持，请打开包含膜支撑的胶囊，轻轻挤压胶囊以轻轻松开支撑。

使用薄钳子抓住硅框架的一角，注意不要触摸框架中心的氮化硅膜，将框架放入层流柜中未覆盖的 Petri 盘中。然后紫外线对膜进行25至30分钟的消毒。在灭菌结束时，添加10微升的附着因子，如聚L-莱辛。

在37摄氏度下孵育25分钟，在湿度为5%的二氧化碳下孵育。然后用200至250微升0.22微升过滤的超纯和超微量水填充无菌48孔板的井。使用细钳子小心地将膜垂直淹没，在一口水中连续冲洗三个 10 秒。

冲洗后，将膜垂直放在无菌 96 孔板的空井中，放在层流罩下，并过夜直到干燥。对于感兴趣的细胞的种子，将涂层膜与平端朝上放在无菌四孔板的一个孔中。在10微升的10微升中，将5倍10添加到氮化硅膜表面，无需接触膜。

掉落物应覆盖整个膜。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳湿度下培养细胞。当细胞开始附着到基板上时，在覆盖每个膜的每个孔壁上缓慢添加一毫升完整的培养基。

然后在37摄氏度和5%的二氧化碳湿度下培养细胞。对于细胞制备的低温移动化，首先打开自动跳柱冰柜，并在 12 孔塑料板中用 37 摄氏度的醋酸铵缓冲液填充适当数量的孔。在冲洗和骤降冷冻膜之前，立即将样品从培养箱中取出，并使用一对快速释放钳子的黑色夹环解锁钳子。

使用未锁定的钳子抓住膜支架，将膜垂直浸入醋酸铵缓冲液中约五秒钟。要去除多余的缓冲液，请将膜支撑的底部压在滤纸上，将框架的每一侧印在滤纸上，不允许膜接触纸张。拆下多余的缓冲液后，打开环境室门，快速将钳子滑入钳子内锁，然后关闭室门。

按污点 A 暴跌。持有氮化硅膜的钳子会迅速陷入低温中。跳投冻结后，用预冷钳子拆下转移容器的盖子，然后按压转移。

氮化硅膜将稍微移动到低温原上方。在快速的单次运动中，滑动并稍微倾斜钳子从钳子联锁中，将钳子直接放入装满氮气的转接容器中的冷冻箱的空槽中。然后松开黑色夹环以释放膜。

对于冷冻冷冻电池的冷冻干燥，请使用冷冻干燥仪器后面板上的摇杆开关为仪器供电。当准备加载样品时，显示屏将显示按输入。将氮化硅膜黄铜支架安装在供应商提供的聚苯乙烯存储容器中提供的样品转移支架的顶部，使液氮水平保持在第一件黄铜片顶部边缘以下约一至两毫米。

将膜与细胞样品侧朝上放在黄铜支架编号的腔中，并在充满液氮的聚苯乙烯泡沫盒中预冷却转移杆。使用杆锁定在完整的组件中，按压进入以打破真空以释放冷冻干燥室的盖子，立即将样品转移到冷冻干燥器室中，并关闭冷冻干燥器室盖。然后立即按开始继续冷冻干燥循环。

在冷冻干燥循环结束时，按压停止以排出腔室并拆下完整组件以接触冷冻干燥样品。这里典型的光学视频显微镜视图冷冻水合乳腺癌细胞系细胞亚培养到聚L-lysine涂层氮化硅膜支持，如所示。冷冻水合细胞的X射线荧光元素图显示钾、硫和锌等生理元素的分布。

在这个具有代表性的示例中，紧密约束的硫元素均匀地分布在细胞内，其模式与观察到的钾相似，代表了对细胞质量轮廓的一个很好的估计。然而，锌分布在细胞核内比细胞糖中表现出更高的信号，细胞糖和细胞核之间的信号有明确定义的分离。在这个典型的光明场显微镜视图冻干原鼠海马神经元直接培养在硅氮化膜上，如所证明，细胞表现出典型的神经形态，不受其培养或保存方法的影响。

柱冻结细胞的X射线荧光成像也揭示了典型的元素分布，这些代表性的冷冻干燥细胞以50至100纳米的空间分辨率表现出来。绘制氮化硅窗口对于在骤冻后获得最薄的冰层细胞至关重要。在亚细胞水平上保持细胞的化学完整性，可以探索细胞的金属组与同步加速器纳米探针以及其他微观分析技术。

由于并非所有同步加速器纳米探针分析都可以在低温下进行，冷冻水合细胞可以进一步冷冻干燥，以方便其在室温下进行分析。在使用液氮时，请记住使用适当的个人防护设备，并且始终在远离火焰的烟气罩中使用乙烷气体。