Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Este vídeo se concentrará na preparação da salmonela de levedura para tomografia crio-elétron Vamos passar pelo fluxo de trabalho do cultivo celular à crio-elétron tomografia Saccharomyces cerevisiae são cultivadas para preparação de espécimes de íons na suspensão É recomendado para trabalhar em condições estéreis dentro da caixa de fluxo laminar dez mililitros de levedura estéril extraída para médio para cultivo celular é adicionado para esterilizar frasco de cultivo um mililitro de glicose estéril 20 por cento é adicionado a o frasco com cultura média uma colônia de leveduras é cuidadosamente colhida de nossa placa de cultivo e transferida para o meio de crescimento preparado no cultivo de frasco de frasco é então coberto com folha e misturado bem para dispersar células cultura celular é colocado na incubadora e cultivado em trinta graus com agitação constante até que a fase exponencial é alcançada cultura celular levedura é cultivada até fase exponencial e densidade física celular é medida por segurar o medidor contra um meio limpo como uma cultura celular de amostra de referência está concentrada em OD1 ou OD30, além de cinco por cento do glicerol antes de o congelamento de branco A superfície das grades eletro-microscópicas é limpa e ativada para aplicação de suspensão celular por grades de plasma são colocadas em câmara de descarga de brilho voltada para cima e o procedimento de limpeza de plasma é definido para 30 a 45 segundos as grades EM têm agora e estão prontas para células aplicação da amostra Vitrificação da suspensão celular de levedura nas grades EM é feita por branco congelando no etano líquido usando máquina vitrobot A preparação do etano líquido ocorre liquefazendo gás etano em um copo de metal resfriado com nitrogênio líquido Em grid com suspensão celular é manchado por papel filtro da parte de trás e por plástico não adesivo dobrado do lado do carbono dianteiro A temperatura dentro da câmara Vitrobot é definida para dezoito graus e umidade a cem por cento de tempo de espera, tempo de mancha e força de mancha são definidos na tela Vitrobot também A grade de descarga de brilho é escolhida por pinças Vitrobot e montada ao instrumento três pontos cinco microliters de Saccharomyces cerevisiae suspensão é aplicada ao lado carbono da grade dentro da câmara climática Vitrobot Suspensão precisa ser adequadamente misturada antes que cada aplicação da grade de grade é blanche congelada nas redes de eletro-microscopia de etano líquido com células vitrificadas são armazenadas sob condições de nitrogênio líquido ou montadas no cartucho de grade para carregar no microscópio cryo SEM A grade com células vitrificadas é então presa no cartucho de grade adequado para o carregamento tanto para os microscópios SEM quanto para os microscópios C-clip ring é montado na ferramenta de recorte e resfriado na grade de nitrogênio líquido é colocado na grade de carbono voltada para baixo e cortado com o A amostra do anel de clipe C é então colocada na caixa de grade especial Espécime para a preparação de lamila é carregado para microscópio FIB/SEM de feixe duplo e apto com pote de carregamento de câmara de preparação crio-estágio é devidamente resfriado e preenchido com suporte de amostra de nitrogênio líquido chamado transporte é colocado na caixa de grade e resfriado, bem como caixa de grade com espécime é transferido do dewar de armazenamento para o pote e grades são colocadas em duas ranhuras no lado carbono de transporte com células voltadas para cima em caso de uso de cartuchos de grade FIB o corte para fora do cartucho de grade deve ser cuidadosamente alinhado a doze horas nas grades de transporte são apertados pelo parafuso e o transporte é virado para baixo para o pote de carga posição de carregamento é colocado na estação de transferência e coberto com tampa Câmara de transferência com pote de carregamento é colocado na parte superior da tampa e bombeado através do transporte de baixo vácuo com grades é fixado na haste e fechado dentro das pequenas câmaras de transferência coletadas para a câmara de preparação são bombeadas e o transporte é inserido em crio-estágio em alto vácuo estágio de câmara SEM é inclinado para quarenta e cinco graus e movido quatro milímetros na posição central da grade inserindo a agulha do sistema de injeção de gás cria camada protetora de orgânico em espécime biológico contra dano de radiação durante o foco As grades de fresagem de feixe de íons são então revestidas com véu fino de metal inorgânico para criar camada condutora na fresagem de feixe de íons de material biológico focada em lamella em aglomerado de células ou monocamada é feita em poucos passos estágio é movido para moagem região de ângulo de interesse é encontrado e padrões de fresagem superior e inferior são criados lamella áspero é moído com diminuição gradual da corrente FIB e espessura lamella o polimento final de lamella is Realizada apenas com padrão superior e baixa corrente FIB para evitar danos frontais e efeito de cortina no feixe de elétrons da superfície lamella mostra o progresso durante o processo de moagem aqui podemos ver a lamella polida final A espessura final da lamella precisa ser inferior a duzentos e cinquenta nanômetros para ser transparente para a transmissão do feixe de elétrons a ilustração de lamella moída em aglomerado de células e monocamada com prós e contras de ambos os tipos de amostras com lamali são muito suavemente transferidos através da câmara de preparação de volta para o pote de carga é resfriado e preenchido com nitrogênio líquido fresco e limpo para evitar a contaminação do gelo de grades lamali moídas são removidos do transporte e devolvidos de volta à caixa de grade espécime com lamali moído é finalmente transferido para transmissão de espectro crioscópio eletrônico tem que ser 90 graus girados antes de inserir para o carregador automático TEM para garantir a adequada orientação da lamella em relação ao acesso de inclinação TEM Lamili são rastreados e região de interesse para aquisição de dados tomográficos crio-elétron é localizado O eixo principal de Lamella é perpendicular ao eixo de inclinação do microscópio para ver o campo de visão em ângulos de alta inclinação método dosimétrico é usado para coletar dados de tomografia crio-elétron coletada tomograma é então processado em software Etomo e segmento monolay software Neste protocolo mostramos como preparar eficientemente uma amostra de células de levedura para uma micro máquina lamella usando a fresagem de feixe de íons focada em crio e como preparar e processar dados de tomografia eletrônica e lamali celular