Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Dieses Video konzentriert sich auf die Vorbereitung von Hefe-Salmonellen für die Kryo-Elektronentomographie Wir werden den Workflow von der Zellkultivierung bis zur Kryo-Elektronentomographie durchlaufen Saccharomyces cerevisiae werden für die Ionenprobenvorbereitung in Suspension kultiviert Es wird empfohlen, unter sterilen Bedingungen in der Laminar-Flow-Box zu arbeiten Zehn Milliliter sterile Hefe, die für die Zellkultivierung extrahiert wurden, werden hinzugefügt, um den Kultivierungskolben zu sterilisieren. Der Kolben mit Kultivierungsmedium eine Hefekolonie wird sorgfältig von unserer Kultivierungsplatte gepflückt und in das vorbereitete Wachstumsmedium im Kultivierungskolben übertragen, dann mit Folie bedeckt und gut gemischt, um Zellen zu dispergieren Zellkultur wird in den Inkubator gegeben und bei dreißig Grad mit konstanter Bewegung kultiviert, bis die exponentielle Phase hefe Zellkultur ist zu exponentieller Phase herangewachsen und zellphysikalische Dichte wird gemessen durch Halten des Messgeräts gegen ein sauberes Medium als Referenzprobe Zellkultur wird auf OD1 oder OD30 konzentriert, zusätzlich zu fünf Prozent Glycerin vor dem Blanchieren Gefrieren Elektromikroskopische Gitteroberfläche wird gereinigt und für die Anwendung der Zellsuspension aktiviert, indem Plasmagitter in eine Glühentladungskammer mit Blick auf die Kohlenstoffseite nach oben gelegt werden und das Verfahren der Plasmareinigung auf dreißig bis fünfundvierzig Sekunden eingestellt ist, die EM-Gitter jetzt haben und sie sind bereit für die Zelle Probenanwendung Die Vitrifikation der Hefezellsuspension auf EM-Gittern erfolgt durch Blanchieren in das flüssige Ethan mit vitrobot-Maschine Die Herstellung von flüssigem Ethan erfolgt durch Verflüssigen von Ethangas in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Metallbecher EM-Gitter mit Zellsuspension wird durch Filterpapier von der Rückseite und durch nicht adhäsiven Kunststoff, der von der Vorderkohlenstoffseite gebogen wird Die Temperatur im Inneren der Vitrobot-Kammer wird auf achtzehn Grad und Luftfeuchtigkeit zu hundert Prozent Wartezeit, Blot-Zeit und Blot-Kraft werden auch auf vitrobot-Bildschirm eingestellt Das Glimmentladungsgitter wird von vitrobot Pinzette gepflückt und am Instrument montiert drei Punkt fünf Mikroliter Saccharomyces cerevisiae Suspension wird auf die Kohlenstoffseite des Gitters in der Vitrobot Klimakammer aufgetragen Suspension muss richtig gemischt werden, bevor jede Anwendung des Gittergitters blanchiert wird in die flüssige Ethanelektromikroskopie-Gitter mit verglasten Zellen werden unter flüssigen Stickstoffbedingungen gelagert oder in die Gitterkartusche zum Laden in das Kryo-REM-Mikroskop montiert Das Gitter mit verglasten Zellen wird dann in der Gitterkartusche befestigt, die sowohl auf REM- als auch auf TEM-Mikroskope geeignet ist C-Clip-Ring wird am Clipping-Werkzeug montiert und in flüssigem Stickstoffgitter abgekühlt wird auf Gitterkartuschenkohlenstoff nach unten gelegt und mit dem Die C-Clip-Ringprobe wird dann in die spezielle Gitterbox gelegt Probe für die Lamila-Vorbereitung wird auf das Zweistrahl-FIB / REM-Mikroskop geladen und mit der Kryo-Stage-Vorbereitungskammer ausgestattet, der Ladetopf wird ordnungsgemäß abgekühlt und mit flüssigem Stickstoff gefüllt Probenhalter namens Shuttle wird in die und abgekühlte Gitterbox mit der Probe wird vom Speicherdewar in den Topf übertragen und Gitter werden in zwei Schlitze im Shuttle-Carbon-Seite mit Zellen nach oben im Falle der Verwendung von FIB-Gitterkartuschen der Ausschnitt aus der Gitterkartusche sollte vorsichtig auf zwölf Uhr ausgerichtet werden, in den Shuttle-Gittern wird durch die Schraube angezogen und das Shuttle wird in die Ladeposition umgedreht Ladetopf wird in transferstation platziert und mit Deckel bedeckt Transferkammer mit Ladetopf wird auf die Oberseite des Deckels gelegt und durch die Niedervakuum-Shuttle mit Gittern wird am Stab befestigt und innerhalb der kleinen Transferkammer geschlossen Kammern, die in der Vorbereitungskammer gesammelt sind, gepumpt und Shuttle wird auf Kryo-Stufe in Hochvakuum-REM-Kammer-Stufe wird auf fünfundvierzig Grad geneigt und vier Millimeter auf der Mittelposition des Gitters bewegt Das Einführen der Nadel des Gasinjektionssystems erzeugt eine Schutzschicht organischer auf biologischer Probe gegen Strahlungsschäden während der Fokussierung Ionenstrahl-Fräsgitter werden dann mit einem dünnen Schleier aus anorganischem Metall beschichtet, um eine leitfähige Schicht auf biologischem Material zu erzeugen Fokussiertes Ionenstrahlfräsen von Lamellen in Zellcluster oder Monoschicht erfolgt in wenigen Schritten Schritt wird in den Fräswinkelbereich von Interesse bewegt und obere und untere Fräsmuster werden erzeugt Raulamellen werden mit allmählicher Abnahme des FIB-Stroms und der Lamellendicke gefräst Das endgültige Polieren der Lamelle ist nur mit oberem Muster und niedrigem FIB-Strom durchgeführt, um Frontendschäden und Vorhangeffekt auf lamellenoberflächen elektronenstrahl zu vermeiden zeigt den Fortschritt während des Fräsprozesses hier können wir die endgültige polierte Lamelle sehen Die endgültige Dicke der Lamelle muss weniger als zweihundertfünfzig Nanometer betragen, um für die Übertragung des Elektronenstrahls transparent zu sein die Illustration der Lamelle, die in Zellcluster und Monoschicht mit Vor- und Nachteilen von gefräst ist Beide Probentypen Gitter mit Lamali werden sehr schonend durch die Vorbereitungskammer zurück in den Ladetopf topf übertragen, abgekühlt und mit frischem und sauberem flüssigem Stickstoff gefüllt, um eine Eiskontamination von gemahlenen Lamali-Gittern zu vermeiden, werden aus dem Shuttle entfernt und zurück zur Gitterbox mit gefrästem Lamali gebracht, das schließlich in das Transmissionselektronen-Kryomikroskopgitter übertragen wird, das neunzig Grad gedreht werden muss, bevor es in die TEM-Autoloader-Kassette eingeführt wird um die richtige Ausrichtung der Lamelle in Bezug auf den TEM-Neigungszugang zu gewährleisten Lamili werden gescreent und Region von Interesse für die Erfassung von kryo-elektronentomographischen Daten ist lokalisiert Lamellenhauptachse ist senkrecht zur Neigungsachse des Mikroskops, um das rechte Sichtfeld bei hohen Neigungswinkeln zu sehen dosimetrische Methode wird verwendet, um Kryo-Elektronentomographie-Daten gesammelt zu sammeln Tomogramm wird dann in Etomo-Software verarbeitet und Monoschicht in Amira segmentiert Software In diesem Protokoll haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie eine Hefezellprobe für eine Lamellenmikromaschine mit kryofokussiertem Ionenstrahlfräsen effizient vorbereiten und wie Sie Elektronentomographiedaten und Zelllamli aufbereiten und verarbeiten