精密切肺切片作为 离体 肺血管结构和收缩力研究的有效工具

精密切肺切片法将保持三维结构和空间方向，无区域偏差，可作为血管和气道收缩力测量的活体替代模型。结合延时成像、蛋白质印迹和 RNA 分析，精确切开的肺切片有助于全面了解信号级联反应，这些级联反应是各种疾病的基础，并有助于更好地了解肺血管疾病的病理生理学。首先，将安乐死的成年小鼠置于仰卧位置，并用胶带将爪子和鼻子贴在桌子上，将其固定到位。

用70%乙醇喷洒小鼠的腹侧表面。使用镊子抬起小鼠腹部皮肤在膀胱的位置，并使用手术剪刀在中线处切开，向上移动到颈部区域以暴露气管。然后用镊子抬起下面的筋膜层，用手术剪刀暴露内脏器官和纵隔室，再次从下切到上。

切开中线的胸骨，露出心脏和肺部。从肝脏和腹部隔室仔细解剖隔膜。找到肠下腔静脉并切割。

定位右心室后，使用25至30号蝶针将0.5毫升1%分馏肝素注射到右心室中，并用10至15毫米PBS缓慢但稳定地冲洗。定位喉部后，使用钝头镊子解剖周围的筋膜和组织，然后将手术缝合线放在气管下方并松散地打结。在气管上放一个高于琴弦的小孔，并用20号钝头针插管。

使用手术结收紧针头和气管周围的缝合线。然后将2.5至4毫升琼脂糖注射到气管中并监测肺部的充气。注射琼脂糖后，将冷PBS倒在肺部以固化琼脂糖。

然后切除手术缝合线上的气管，并通过去除任何粘连和筋膜将肺和心脏从纵隔上解剖。凝固后，将DMEM中的组织放在冰上的培养皿中，然后立即使用振动机切开一个叶片。为了准备肺切片，用超级胶水将样品连接到平台上，保持内侧朝上。

然后用 PBS 填充样品容器。在容器中装满冰块，以保持周围的PBS和样品冷却。打开振动器。

将厚度调整为300微米，频率调整为100赫兹，振幅调整为0.6毫米，速度调整为每秒5微米。使用内六角扳手，将刀片架转到安全位置，然后打开钳口插入刀片。然后用内六角扳手拧紧钳口。

将样品放在盒子上，确保其浸没在PBS中。将盒子向上滑动到正确的位置，并确保其牢固。将刀片架转入适当的位置进行切片。

将振动片向上移动到块的边缘，然后手动降低刀片，直到它与样品顶部均匀。确认设置并运行振动器。切开新鲜切片后，从PBS中取出样品，并将其放入含有10毫升含有一次性抗真菌抗生素的DMEM的无菌培养皿中。

将所有切片放入培养皿中后，将刀片完全缩回，并使用内六角扳手将刀片抬高到安全位置。将样品储存在37摄氏度的DMEM中。并将振动切片片放在显微镜载玻片上。

使用清洁湿巾去除多余的介质。将样品放在相差显微镜上，并使用10至20倍放大倍率来识别容器。然后加入500微升血管收缩剂，例如60毫摩尔氯化钾或一微摩尔内皮素-1以完全浸没载玻片。

通过录制30到60秒来观察和捕获视频。在开始实验之前，用一升液氮填充一个小的聚苯乙烯泡沫盒，并在装有液氮的容器中放置两个1.5毫升的微量离心管。将四到五片新鲜的振动切片放入砂浆碗中。

将5至10毫升液氮倒在切片上，并在液氮蒸发之前快速使用杵将切片研磨成粉末。使用预冷的钢制实验室铲斗将粉末舀入两个冷冻的微量离心管中，并通过加入500微升用于RNA分离的RNA提取试剂或500微升用于蛋白质裂解的RIPA缓冲液来裂解粉末。在代表性的可行性实验中，从第0天到第1天和第9天到第10天检测到PCLS切片的颜色变化。

该溶液最初是蓝色的，一夜之间变成粉红色，显示出可行性。颜色变化通常发生在一到四个小时内，但可能需要更长的时间。此处显示了振动切片机制备的组织在562和613纳米波长处的吸光度的每日差异。

使用内皮素-1和氯化钾的振动切片机制备的肺组织中脉管系统的收缩可以在这里可视化。在他莫昔芬注射后一周的细胞中保存tdTomato标记在这些肺切片中得到了证明。最重要的是，在进行额外的实验和成像之前，要很好地进行肺部清除和充气步骤，以从循环中去除所有血液。

除血管疾病外，PCLS还可用于研究气道相关疾病的生理生物学，并可在临床相关情况下在人体肺组织上进一步测试。