Hassas kesim akciğer dilimleri yöntemi, yapıyı ve mekansal yönelimleri bölgesel önyargı olmadan üç boyutta koruyacak ve damarlar ve hava yolu kontritite ölçümleri için canlı taşıyıcı model görevi görecektir. Zaman atlamalı görüntüleme, Batı lekesi ve RNA analizi ile birlikte, hassas kesilmiş akciğer dilimleri, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur. Başlamak için, ötenazi yetişkin fareyi bir supine konumuna getirin ve pençeleri ve burnu yapışkan bantla masaya bantlayarak yerine sabitleyin.
Farenin ventral yüzeyini% 70 etanol ile püskürtün. Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde kaldırmak için önpsezleri ve orta çizgide kesmek için cerrahi makası kullanın, nefes nefese maruz kalmak için servikal bölgeye üstün hareket edin. Daha sonra alttaki fasya tabakasını kaldırmak için cımbız kullanın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanın, yine üstünden daha düşük kesim.
Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin. Diyaframı karaciğerden ve karın bölmesinden dikkatlice ayırın. Bağırsakların altındaki alt vena kavayı bulun ve kesin.
Sağ ventrikülü bulduktan sonra, 25 ila 30 kalibrelik bir kelebek iğnesi kullanarak sağ ventrikülün içine %1 fraksiyone heparinin 0,5 mililitresini enjekte edin ve 10 ila 15 milimetre PBS ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın. Gırtlağın yerini tespit ettikten sonra, çevredeki fasya ve dokuyu parçalamak için künt uçlu cımbız kullanın, ardından cerrahi sütür nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın. Nefes borusuna ipe göre daha üstün küçük bir delik yerleştirin ve 20 kalibrelik kör uçlu bir iğne ile kanüle edin.
Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın. Daha sonra nefes borusuna 2,5 ila 4 mililitre agazo enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin. Agarose enjeksiyonundan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk PBS dökün.
Daha sonra nefes borusu cerrahi dikişten daha üstün kesin ve herhangi bir yapışıklık ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin. Katılaşmadan sonra, DMEM'deki dokuyu buz üzerindeki bir Petri kabına yerleştirin ve hemen bir vibratom makinesi kullanarak bir lobu dilimleme işlemine devam edin. Akciğer dilimlerini hazırlamak için, örneği platforma süperglue ile takın ve medial tarafı yukarı bakacak şekilde tutun.
Ardından örnek kabı PBS ile doldurun. Çevredeki PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için kabı buzla doldurun. Vibratomu aç.
Kalınlığı 300 mikrometreye, frekansı 100 Hertz'e, genliği 0,6 milimetreye ve hızı saniyede beş mikrometreye ayarlayın. Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın. Sonra çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın.
Örneği PBS'ye batırıldıklarından emin olarak kutunun üzerine yerleştirin. Kutuyu doğru konuma getirin ve güvenli olduğundan emin olun. Bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.
Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt. Ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın. Taze dilimler kesildikten sonra, örnekleri PBS'den çıkarın ve bir kerelik antimykotik antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.
Tüm dilimleri bir Petri kabına yerleştirdikten sonra, bıçağı tamamen geri çekin ve bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın. Örnekleri DMEM'de 37 santigrat derecede saklayın. Ve bir vibratom dilimini mikroskop kaydıranına yerleştirin.
Fazla ortamı çıkarmak için bir temizleme mendili kullanın. Numuneyi faz kontrastı mikroskopisine yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10 ila 20X büyütme kullanın. Daha sonra slaydı tamamen batırmak için 60 milimolar potasyum klorür veya bir mikromoler endotelin-1 gibi 500 mikrolitre vazokonstriktör ekleyin.
30 ila 60 saniye kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın. Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu bir litre sıvı azotla doldurun ve kabın içine sıvı nitrojen ile iki adet 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Bir harç kabına dört ila beş taze vibratom dilimi yerleştirin.
Dilimlerin üzerine 5 ila 10 mililitre sıvı azot dökün ve sıvı nitrojen buharlaşmadan önce dilimleri toz haline getirmek için pestle'yi hızla kullanın. Tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeyle almak için önceden soğutulmuş bir çelik laboratuvar kepçesi kullanın ve RNA izolasyonu için 500 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi veya protein liziz için 500 mikrolitre RIPA tamponu ekleyerek tozu izleyin. Temsili canlılık deneyinde, PCLS dilimlerinin renk değişimi sıfırdan bire ve dokuzuncu günden 10'a kadar tespit edildi.
Çözüm başlangıçta maviydi ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle bir ila dört saat içinde meydana geldi, ancak daha uzun bir süre gerekebilir. Vibratomla hazırlanan doku için 562 ve 613 nanometre dalga boylarındaki absorbans arasındaki günlük fark burada gösterilmiştir.
Endotelin-1 ve potasyum klorür kullanılarak vibratomla hazırlanmış bir akciğer dokusundaki vaskülatın daralması burada görselleştirilebilir. Tamoksifen enjeksiyonundan bir hafta sonra hücrelerde tdTomato etiketlemesinin korunması bu akciğer dilimlerinde gösterilmiştir. Ek deneyler ve görüntülemelerden önce tüm kanı dolaşımdan çıkarmak için akciğer temizleme ve enflasyon adımını iyi yapmak en önemlisidir.
Vasküler hastalıklara ek olarak, PCLS hava yolu ile ilgili hastalığın fizyolojisini incelemek için uygulanabilir ve klinik olarak ilgili senaryolarda insan akciğer dokuları üzerinde daha fazla test edilebilir.
