Метод прецизионного разрезания легких позволит сохранить структуру и пространственную ориентацию в трех измерениях без регионального смещения и может служить живой суррогатной моделью для измерений сократимости сосудов и дыхательных путей. В сочетании с покадровой визуализацией, вестерн-блоттом и анализом РНК, прецизионные разрезанные срезы легких способствуют всестороннему пониманию сигнальных каскадов, которые лежат в основе широкого спектра расстройств и приводят к лучшему пониманию патофизиологии при заболеваниях легочных сосудов. Для начала поместите усыпленную взрослую мышь в лежачее положение и закрепите ее на месте, приклеив лапы и нос к столу скотчем.
Опрыскиваем брюшную поверхность мыши 70% этанолом. Используйте щипцы, чтобы поднять брюшную кожу мыши в месте расположения мочевого пузыря и хирургические ножницы, чтобы разрезать по средней линии, двигаясь выше шейного отдела, чтобы обнажить трахею. Затем используйте пинцет, чтобы поднять подстилающей слой фасции и используйте хирургические ножницы, чтобы обнажить висцеральные органы и медиастинальный отсек, снова разрезая ниже верхнего.
Отрежьте грудину по средней линии, чтобы обнажить сердце и легкие. Тщательно рассекает диафрагму от печени и брюшного отсека. Расположить нижнюю полую вену под кишечником и разрезать ее.
После обнаружения правого желудочка используйте иглу бабочки 25-30 калибра, чтобы ввести 0,5 миллилитра 1% фракционированного гепарина в правый желудочек и медленно, но неуклонно промывать его от 10 до 15 миллиметров PBS. После обнаружения гортани используйте тупой пинцет для рассечения окружающей фасции и ткани, затем поместите хирургический шов под трахею и свободно завяжите хирургический узел. Поместите небольшое отверстие в трахее выше струны и канюль с помощью тупой иглы 20 калибра.
Затяните шов вокруг иглы и трахеи с помощью хирургического узла. Затем вводят от 2,5 до 4 миллилитров агарозы в трахею и контролируют инфляцию легких. После инъекции агарозы вылейте холодный PBS на легкое, чтобы затвердеть агарозу.
Затем разрезают трахею, превосходящую хирургический шов, и рассекли легкие и сердце от средостения путем удаления любых спаек и фасций. После затвердевания поместите ткань в DMEM в чашку Петри на льду и сразу же приступайте к нарезке одной доли с помощью вибратомной машины. Чтобы подготовить легкие ломтики, прикрепите образец к платформе с помощью суперклея, держа медиальную сторону лицом вверх.
Затем заполните контейнер для образцов PBS. Наполните контейнер льдом, чтобы сохранить окружающий PBS и образец холодным. Включите вибратом.
Отрегулируйте толщину до 300 микрометров, частоту до 100 Гц, амплитуду до 0,6 миллиметра и скорость до пяти микрометров в секунду. Используя гаечный ключ Allen, поверните держатель лезвия в безопасное положение и откройте челюсти, чтобы вставить лезвие. Затем затяните челюсти гаечным ключом Аллена.
Поместите образец на коробку, убедив, что он погружен в PBS. Сдвиньте коробку вверх в правильном положении и убедитесь, что она надежно закреплена. Поверните держатель лезвия в соответствующее положение для нарезки.
Поднесите лезвие вибратома к краю блока и вручную опустите лезвие до тех пор, пока оно не сравняется с верхней частью образца. Подтвердите настройки и запустите вибратом. После того, как свежие ломтики нарезаны, извлеките образцы из PBS и поместите их в стерильную чашку Петри с 10 миллилитрами DMEM, содержащими одноразовый антимикотический антибиотик.
Поместив все ломтики в чашку Петри, полностью втяните лезвие и используйте гаечный ключ Аллена, чтобы поднять лезвие в безопасное положение. Храните образцы в DMEM при 37 градусах Цельсия. И поместите срез вибратома на слайд микроскопа.
Используйте чистящую салфетку, чтобы удалить лишнюю среду. Поместите образец на фазовую контрастную микроскопию и используйте увеличение от 10 до 20X для идентификации сосуда. Затем добавьте 500 микролитров сосудосуживающих средств, таких как 60 миллимоляров хлорида калия или один микромолярный эндотелин-1, чтобы полностью погрузить слайд.
Наблюдайте и захватывайте видео, записывая в течение 30-60 секунд. Перед началом эксперимента заполните небольшую коробку из пенополистирола одним литром жидкого азота и поместите в емкость с жидким азотом две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Поместите четыре-пять свежих ломтиков вибратома в миску для раствора.
Налейте от 5 до 10 миллилитров жидкого азота поверх ломтиков и быстро используйте пестик, чтобы измельчить ломтики в порошок до того, как жидкий азот испарится. Используйте предварительно охлажденный стальной лабораторный совок, чтобы зачерпнуть порошок в две охлажденные микроцентрифужные трубки и лизировать порошок, добавив 500 микролитров реагента экстракции РНК для выделения РНК или 500 микролитров буфера RIPA для лизиса белка. В репрезентативном эксперименте по жизнеспособности изменение цвета срезов PCLS было обнаружено с нулевого дня до одного и с девятого по 10-й день.
Раствор изначально был синим и стал розовым за ночь, демонстрируя жизнеспособность. Изменение цвета обычно происходило в течение одного-четырех часов, но может потребоваться более длительное время. Суточная разница между поглощением на длинах волн 562 и 613 нанометров для ткани, подготовленной вибратомом, показана здесь.
Здесь можно визуализировать сужение сосудистой системы в вибратомной легочной ткани с использованием эндотелина-1 и хлорида калия. Сохранение маркировки tdTomato в клетках через неделю после инъекции тамоксифена демонстрируется в этих срезах легких. Наиболее важно хорошо выполнить очистку легких и этап инфляции, чтобы удалить всю кровь из кровообращения перед дополнительными экспериментами и визуализацией.
В дополнение к сосудистым заболеваниям, PCLS может применяться для изучения физиобиологии заболеваний, связанных с дыхательными путями, и может быть дополнительно протестирован на легочных тканях человека в клинически значимых сценариях.
