Die Methode der präzisionsgeschnittenen Lungenschnitte bewahrt die Struktur und die räumlichen Orientierungen in drei Dimensionen ohne regionale Verzerrung und kann als Live-Surrogatmodell für Gefäß- und Atemwegskontraktilitätsmessungen dienen. In Kombination mit Zeitraffer-Bildgebung, Western Blot und RNA-Analyse tragen präzisionsgeschnittene Lungenschnitte zum umfassenden Verständnis von Signalkaskaden bei, die einer Vielzahl von Erkrankungen zugrunde liegen und zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen. Legen Sie zunächst die eingeschläferte erwachsene Maus in Rückenlage und befestigen Sie sie, indem Sie die Pfoten und die Nase mit Klebeband an den Tisch kleben.
Besprühen Sie die ventrale Oberfläche der Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchhaut der Maus an der Stelle der Blase anzuheben, und eine chirurgische Schere, um an der Mittellinie zu schneiden und sich überlegen zur Zervixregion zu bewegen, um die Luftröhre freizulegen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die darunter liegende Faszienschicht anzuheben, und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die viszeralen Organe und das mediastinale Kompartiment freizulegen, die wiederum minderwertig als überlegen schneiden.
Schneiden Sie das Brustbein an der Mittellinie ab, um Herz und Lunge freizulegen. Sezieren Sie das Zwerchfell vorsichtig von der Leber und dem Bauchkompartiment. Lokalisieren Sie die untere Hohlvene unter dem Darm und schneiden Sie sie.
Nachdem Sie den rechten Ventrikel lokalisiert haben, verwenden Sie eine 25 bis 30 Gauge Schmetterlingsnadel, um 0,5 Milliliter 1% fraktioniertes Heparin in den rechten Ventrikel zu injizieren und ihn langsam aber stetig mit 10 bis 15 Millimeter PBS zu spülen. Nachdem Sie den Kehlkopf lokalisiert haben, verwenden Sie eine stumpfe Spitzenpinzette, um die umgebende Faszie und das Gewebe zu sezieren, legen Sie dann die chirurgische Naht unter die Luftröhre und binden Sie locker einen chirurgischen Knoten. Legen Sie ein kleines Loch in die Luftröhre, das der Schnur überlegen ist, und kanülieren Sie mit einer 20-Gauge-Stumpfnadel.
Ziehen Sie die Naht um die Nadel und die Luftröhre mit einem chirurgischen Knoten fest. Dann injizieren Sie 2,5 bis 4 Milliliter Agarose in die Luftröhre und überwachen Sie die Inflation der Lunge. Nach der Agarose-Injektion kaltes PBS über die Lunge gießen, um die Agarose zu verfestigen.
Schneiden Sie dann die Luftröhre der chirurgischen Naht überlegen und sezieren Sie die Lunge und das Herz vom Mediastinum, indem Sie Alle Adhäsionen und Faszien entfernen. Legen Sie das Gewebe nach der Erstarrung in DMEM in eine Petrischale auf Eis und schneiden Sie sofort einen Lappen mit einer Vibratommaschine auf. Um die Lungenscheiben vorzubereiten, befestigen Sie die Probe mit Sekundenkleber an der Plattform, wobei die mediale Seite nach oben gerichtet bleibt.
Füllen Sie dann den Probenbehälter mit PBS. Füllen Sie den Behälter mit Eis, um das umgebende PBS und die Probe kalt zu halten. Schalten Sie das Vibratom ein.
Stellen Sie die Dicke auf 300 Mikrometer, die Frequenz auf 100 Hertz, die Amplitude auf 0,6 Millimeter und die Geschwindigkeit auf fünf Mikrometer pro Sekunde ein. Drehen Sie den Klingenhalter mit einem Inbusschlüssel in die sichere Position und öffnen Sie die Backen, um eine Klinge einzuführen. Ziehen Sie dann die Kiefer mit einem Inbusschlüssel fest.
Legen Sie die Probe auf die Box und stellen Sie sicher, dass sie in PBS eingetaucht ist. Schieben Sie die Box in die richtige Position und stellen Sie sicher, dass sie sicher ist. Drehen Sie den Klingenhalter in die richtige Position zum Schneiden.
Bringen Sie die Vibrationsklinge an den Rand des Blocks und senken Sie die Klinge manuell ab, bis sie sich mit der Oberseite der Probe befindet. Bestätigen Sie die Einstellungen und führen Sie das Vibratom aus. Nachdem die frischen Scheiben geschnitten wurden, entfernen Sie die Proben aus dem PBS und legen Sie sie in eine sterile Petrischale mit 10 Millilitern DMEM, die ein einmaliges antimykotisches Antibiotikum enthalten.
Nachdem Sie alle Scheiben in eine Petrischale gelegt haben, ziehen Sie die Klinge vollständig ein und verwenden Sie den Inbusschlüssel, um die Klinge in eine sichere Position zu bringen. Lagern Sie die Proben in DMEM bei 37 Grad Celsius. Und legen Sie eine Vibratomscheibe auf einen Objektträger.
Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um überschüssiges Medium zu entfernen. Legen Sie die Probe auf die Phasenkontrastmikroskopie und verwenden Sie eine 10- bis 20-fache Vergrößerung, um ein Gefäß zu identifizieren. Dann fügen Sie 500 Mikroliter Vasokonstriktoren hinzu, wie 60 Millimolar Kaliumchlorid oder ein mikromolares Endothelin-1, um den Objektträger vollständig zu untertauchen.
Beobachten und erfassen Sie das Video, indem Sie es 30 bis 60 Sekunden lang aufnehmen. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, füllen Sie eine kleine Polystyrolschaumbox mit einem Liter flüssigem Stickstoff und legen Sie zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in den Behälter mit flüssigem Stickstoff. Vier bis fünf frische Vibratomscheiben in eine Mörtelschüssel geben.
Gießen Sie 5 bis 10 Milliliter flüssigen Stickstoff auf die Scheiben und verwenden Sie den Stößel schnell, um die Scheiben zu Pulver zu mahlen, bevor der flüssige Stickstoff verdampft. Verwenden Sie einen vorgekühlten Stahl-Laborschaufel, um das Pulver in die beiden gekühlten Mikrozentrifugenröhrchen zu schöpfen und das Pulver zu lysieren, indem Sie 500 Mikroliter RNA-Extraktionsreagenz für die RNA-Isolierung oder 500 Mikroliter RIPA-Puffer für die Proteinlyse hinzufügen. Im repräsentativen Lebensfähigkeitsexperiment wurde die Farbänderung der PCLS-Scheiben von Tag Null auf Eins und Tag neun auf 10 nachgewiesen.
Die Lösung war zunächst blau und wurde über Nacht rosa, was die Lebensfähigkeit demonstrierte. Farbwechsel traten typischerweise innerhalb von ein bis vier Stunden auf, aber eine längere Zeit kann notwendig sein. Der tägliche Unterschied zwischen der Absorption bei 562 und 613 Nanometer Wellenlängen für das vibratomvorbereitete Gewebe wird hier gezeigt.
Die Verengung des Gefäßsystems in einem vibromvorbereiteten Lungengewebe mit Endothelin-1 und Kaliumchlorid kann hier visualisiert werden. Die Konservierung der tdTomato-Markierung in Zellen eine Woche nach der Tamoxifen-Injektion wird in diesen Lungenschnitten demonstriert. Es ist am wichtigsten, den Lungenreinigungs- und Aufblasschritt gut durchzuführen, um das gesamte Blut vor zusätzlichen Experimenten und Bildgebung aus dem Kreislauf zu entfernen.
Zusätzlich zu Gefäßerkrankungen kann PCLS angewendet werden, um die Physiobiologie von Atemwegserkrankungen zu untersuchen, und kann in klinisch relevanten Szenarien an menschlichem Lungengewebe weiter getestet werden.
