שיטת פרוסות ריאות חתוכות מדויקות תשמור על המבנה והכיוון המרחבי בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ויכולה לשמש מודל פונדקאי חי לכלי שיט ומדידות התכווצות דרכי הנשימה. בשילוב עם הדמיה בזמן, כתם מערבי וניתוח RNA, פרוסות ריאות חתוכות במדויק תורמות להבנה המקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ומובילות להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיות. כדי להתחיל, מניחים את העכבר הבוגר המתחסד בתנוחה על-סופית ומאבטחים אותו במקום על ידי הדבקת כפות הרגליים והאף לשולחן עם סרט הדבקה.
לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70%אתנול. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הבטן של העכבר במיקום של שלפוחית השתן ומספריים כירורגיים לחתוך בקו האמצע, נע מעולה לאזור צוואר הרחם כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להרים את שכבת fascia הבסיסית ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחשוף את האיברים הקרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.
תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה. לנתח את הסרעפת בזהירות מהכבד ותא הבטן. אתר את הוועד הנתון הנחות מתחת למעיים וחתוך אותו.
לאחר איתור החדר הימני, השתמש במחט פרפר 25 עד 30 מד כדי להזריק 0.5 מיליליטר של 1%הפרין מופרד לחדר הימני לשטוף אותו לאט אבל בהתמדה עם 10 עד 15 מילימטרים של PBS. לאחר איתור הגרון, השתמש פינצטה קצה קהה לנתח את fascia ורקמות שמסביב, ולאחר מכן למקם את התפר הכירורגי מתחת קנה הנשימה ולקשור באופן רופף קשר כירורגי. מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיפה על החוט ומתכרבלים עם מחט באורך 20 מד.
הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי. לאחר מכן הזריקו 2.5 עד 4 מיליליטר של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה. לאחר הזרקת אגרוז, לשפוך PBS קר על הריאה כדי לחזק את האגורז.
לאחר מכן לחתוך את קנה הנשימה מעולה התפר הכירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia. לאחר התגבשות, מניחים את הרקמה ב- DMEM בצלחת פטרי על קרח, ומיד ממשיכים לתוחך אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום. כדי להכין את פרוסות הריאה, חבר את הדגימה לפלטפורמה עם דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודל פונה כלפי מעלה.
לאחר מכן מלא את הגורם המכיל לדוגמה ב- PBS. מלא את המיכל בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר. תדליק את הוויברטום.
כוונן את העובי ל-300 מיקרומטר, תדירות ל-100 הרץ, משרעת ל-0.6 מילימטרים ומהירות לחמישה מיקרומטר לשנייה. בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב. ואז להדק את הלסתות עם מפתח ברגים אלן.
הנח את הדגימה על הקופסה, והבטח שהיא שקועה ב- PBS. החלק את התיבה למעלה במיקום הנכון וודא שהיא מאובטחת. הפוך את מחזיק הלהב לעמדה המתאימה ל חיתוך.
מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה. אשר את ההגדרות והפעל את הוויברטום. לאחר פרוסות טריות נחתכות, להסיר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילית עם 10 מיליליטר של DMEM המכיל אנטיביוטיקה אנטי-ממיקוטית חד פעמית.
לאחר הנחת כל הפרוסות בצלחת פטרי, לסגת הלהב לחלוטין ולהשתמש מפתח אלן להרים את הלהב למצב בטוח. אחסן את הדגימות ב- DMEM ב 37 מעלות צלזיוס. ומניחים פרוסת ויברטום על שקופית מיקרוסקופ.
השתמש במחיקה לניקוי כדי להסיר מדיום עודף. הנח את הדגימה על מיקרוסקופיית ניגודיות הפאזה והשתמש בהגדלה של פי 10 עד 20 כדי לזהות כלי שיט. לאחר מכן להוסיף 500 microliters של vasoconstrictors, כגון 60 מילימולר אשלגן כלורי או אנדותלין מיקרומולרי אחד כדי להטביע לחלוטין את השקופית.
צפה ולכוד את הווידאו על-ידי הקלטה למשך 30 עד 60 שניות. לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה בליטר אחד של חנקן נוזלי והניחו שתי צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר במיכל עם חנקן נוזלי. מניחים ארבע עד חמש פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.
יוצקים 5 עד 10 מיליליטר של חנקן נוזלי על גבי הפרוסות ולהשתמש במהירות עלה לטחון את הפרוסות לאבקה לפני החנקן הנוזלי מתאדה. השתמשו בסקופ מעבדת פלדה מצוננת מראש כדי לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות מיקרוצנטריפוגה צוננים ולזר את האבקה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ריאגנט מיצוי RNA לבידוד RNA או 500 מיקרוליטרים של חיץ RIPA לתסיסת חלבון. בניסוי הכדאיות הייצוגית, שינוי הצבע של פרוסות PCLS זוהה מיום אפס ליום אחד ויום תשע עד 10.
הפתרון היה בתחילה כחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל בתוך שעה עד ארבע שעות, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר. ההבדל היומי בין ספיגה ב 562 ו 613 אורכי גל ננומטר עבור הרקמה מוכנה רטט מוצג כאן.
התכווצות כלי העיון ברקמת ריאה מוכנה רטט באמצעות אנדותלין-1 ואשלגן כלורי ניתן לדמיין כאן. שימור תיוג tdTomato בתאים שבוע לאחר הזרקת טמוקסיפן מוכח בפרוסות ריאות אלה. חשוב ביותר לבצע את ניקוי הריאות ואת צעד האינפלציה היטב כדי להסיר את כל הדם מהמחזור לפני ניסויים נוספים והדמיה.
בנוסף למחלות כלי דם, ניתן ליישם PCLS כדי לחקור פיזיוביולוגיה של מחלות הקשורות דרכי הנשימה, וניתן לבדוק עוד יותר על רקמות הריאה האנושית בתרחישים רלוונטיים מבחינה קלינית.
