该方法演示了用单分子计算法对液体样品中蛋白质量进行量化的校准。具体来说，它可以说明蛋白质群如何在每个分子水平上被荧光标记。先前的方法进行了批量测量，以分析荧光分子和蛋白质分子的摩尔比，但它们不能揭示异质蛋白质群是如何实际标记的。
我们的方法可以直接在单分子水平上做到这一点。我们的方法可以扩展到超敏感和先进的分子浓度测定，这将导致未来的诊断方法，从而在样品中有效地发现致病分子。我们的方法可用于使用荧光抗体进行单一蛋白质物种分析，以及使用非特异性标签对通过电泳或色谱分离的所有蛋白质进行多物种分析。
该技术最关键的一点是获得数据可重复性。我建议在测量多个样品时尽可能保持相同的实验条件。该技术的可视化演示将提供如何使每个实验步骤稳定且可重复。
它还会显示一些不寻常的步骤在生物化学协议，如旋转涂层和洗涤显微镜盖玻片。若要开始此过程，请准备文本协议中概述的 lysing 缓冲区和 1%Tween-20。使用氢氧化钠将pH调至12。
将 100 微升的开水缓冲液与一个摩尔滴滴涕的微升和 4 个 50%CHAPS 的微升混合。添加一个微升的准备好的细胞培养，通过慢移液使溶液均质，以避免气泡。在黑暗中室温下孵育五分钟，轻轻搅拌。
然后，通过缓慢向上和向下移液，使溶液重新变生。加入一微克的Cy3 NHS酯染料，通过减慢移液速度使溶液均匀化，避免气泡。在黑暗中在室温下孵育10分钟，轻轻搅拌。
重复此过程，添加相同数量的染料并孵育样品一次。加入 100 微升 0.8 摩尔 HEPES-氢氧化钠，将溶液的 pH 调节为 7.2 并淬火反应。缓慢移液器上下，使溶液均质化。
接下来，加入20微升生物素-2胺和5微升EDC。通过缓慢向上和向下移液使溶液均匀。在黑暗中在室温下孵育一小时，轻轻搅拌。
在此之后，使用具有 10 千吨截止的超滤柱去除任何未反应的标签试剂并浓缩样品。在对蛋白质样本和分子梯执行标准 SDS-PAGE 后，对凝胶进行成像，以确定蛋白质波段的位置。使用锋利的刀片切出含有蛋白质部分的凝胶部分，这些份量基于带的位置。
首先，设置 22 毫米由 22 毫米的盖玻片，0.15 毫米厚的盖玻片。使用等离子清洁剂将盖玻片暴露在空气等离子体中一分钟，以清洁和激活其表面。接下来，使用旋转涂布器在 500RPM 时用 200 微升的 avadin 缓冲器旋转盖玻片，在 500RPM 下旋转 5 秒钟，随后在 1000RPM 下旋转 30 秒。
在室温下孵育盖玻片15分钟，让其空气干燥。要为蛋白质样品准备盖玻片，请使用已稀释的蛋白质样本。将稀释样品的 100 微升放在涂覆盖玻片的中心。
在室温下在黑暗中孵育15分钟。为了准备正对，将100微升纯化荧光生物素放在5微摩尔 HEPES-氢氧化钠中，在pH 7.2的中心处，放在一个镀膜盖玻片的中心。在室温下在黑暗中孵育15分钟。
为了准备负对，旋转涂层等离子盖玻片与200微升5 HEPES-氢氧化钠与两毫克每毫升BSA没有阿瓦丁。在pH 7.2的5微摩尔 HEPES-氢氧化钠中加入100微升到纯化荧光生物素中。在黑暗中在室温下孵育15分钟。
在此之后，通过边缘移液，用 200 微升蒸馏水冲洗每个盖玻片，确保不要用移液器尖端触摸盖玻片的中间。重复此洗涤三次。然后，将等数量的新盖玻片暴露在空气等离子体中一分钟。
将清洁的盖玻片放在每个样品装盖玻片的顶部，以避免干燥。启动宽场或消逝场荧光显微镜。在显微镜上设置盖玻片并找到焦点。
然后，执行磁贴扫描以获取至少 100 个图像。在这项研究中，与SDS-PAGE分离后，对细胞中每个标记蛋白物种的标签均质进行量化。这里显示了来自 HeLa 细胞 lysate 的不同蛋白质分子量分数的原始图像数据，以及正负对比。
虽然蛋白质样本和阳性对照显示每个图像 100 到 500 个点之间，但负对照显示的很少或根本没有。这表明，该工艺充分抑制染料与盖玻片表面的非特异性结合。蛋白质样本的点强度直方图和正对照呈现多个峰值，分别表示染料与蛋白质和 avadin 四聚体结构中原胺的随机结合。
所有斑点都显示出闪烁和逐步光漂白与连续激光激发，突出观察在单个分子水平。然后，根据每个蛋白质样本中的斑点数与正对照中的点数之比计算标签占用率。从 HeLa 细胞 lysate 样品中测量的 LO 范围从 50% 的分子量分数到 90% 的分子量分数。
整个蛋白质组样品的LO，没有分离，被认为是72%的关键使用新鲜制作的试剂，并避免任何灰尘，特别是在准备盖玻片。按照这个程序，可以在一定体积进行单分子计数分析，以量化每种蛋白质的浓度。例如，可以对任何原始产品或凝胶和毛细管电泳产品进行分析。
该技术为将单分子荧光成像应用于分子医学、有机化学和组理分析铺平了道路。通过在集中和数字之间缩小概念。浓缩氢氧化钠具有腐蚀性，处理时应佩戴足够的保护。
此外，高功率激光辐射可能会导致眼睛损伤，因此可能会佩戴护目镜。
